Un metodo efficace per l'isolamento di RNA altamente purificato da semi per l'utilizzo in Quantitative Analysis trascrittoma
Summary
We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.
Abstract
Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.
Introduction
Le piante producono semi, che danno origine alla generazione successiva. I semi accumulano grandi quantità di riserve di stoccaggio, come gli oli, carboidrati e proteine, per la crescita post-germinativo. Gli esseri umani utilizzano le riserve di stoccaggio di semi come fonti di alimenti e mangimi, e quindi semi di piante sono uno dei principali fornitori di materia organica commestibili in tutto il mondo. Aumentare le rese di semi è una sfida importante in scienza delle piante.
Poiché le riserve di riserva dei semi sono valore commerciale fonti di cibo e materiali industriali, i meccanismi molecolari alla base della regolazione del metabolismo di queste riserve sono stati ampiamente studiati 1-6. Ulteriori chiarire questi meccanismi sarà utile per aumentare le rese di semi di colture. I semi si sviluppano in ovaie di piante dopo la fecondazione, e maturano attraverso una serie di fasi di sviluppo 1,6,7. Inoltre la comprensione del meccanismo molecolare dello sviluppo del seme di base richiede dettagliata, Precisi profili di espressione genica di una serie di sviluppo semi da produrre. Tuttavia, elevate quantità di oli, proteine, carboidrati e polifenoli in semi di piante rendono difficile isolare RNA altamente purificato, che preclude precisa profili di espressione genica.
Qui, si introduce un metodo efficiente per l'isolamento di RNA da semi oleosi contenenti grandi quantità di oli, proteine e polifenoli. Usando questo metodo, i ricercatori saranno in grado di preparare RNA altamente purificato. Tale RNA sarà utile per il monitoraggio dei cambiamenti trascrizionali di geni chiave che controllano la regolazione del metabolismo delle riserve di stoccaggio di semi in via di sviluppo e dei semi oleosi maturi.
Protocol
Representative Results
Discussion
profili di espressione genica contribuiscono alla nostra comprensione della fisiologia vegetale; Pertanto, metodi di isolamento specifica di RNA sono stati sviluppati per ogni condizione di esempio 9-12. Abbiamo studiato i processi che sono stati inibiti durante l'isolamento di RNA dai semi e ha scoperto che l'RNA di legame alle membrane di silice è stato gravemente inibito. Grandi quantità di olio, proteine e polifenoli inibiscono l'isolamento di RNA. Abbiamo modificato il processo di est…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo lo staff di Genomica Funzionale Struttura e Spettrografia e Bioimmagini strumento, nibb fondamentali strutture di ricerca, e modello di ricerca delle piante Fondo, nibb Bioresource Center.
Materials
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
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