Summary

Un método eficiente para el aislamiento de ARN altamente purificada a partir de semillas para uso en el Análisis Cuantitativo de transcriptoma

Published: January 11, 2017
doi:

Summary

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Abstract

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

Introduction

Las plantas producen semillas, que dan lugar a la generación siguiente. Las semillas se acumulan grandes cantidades de reservas de almacenamiento, tales como aceites, hidratos de carbono y proteínas, para el crecimiento post-germinativa. Los seres humanos utilizan las reservas de almacenamiento de las semillas como fuentes de alimentación humana y animal, y por lo tanto las semillas de plantas son uno de los principales proveedores de materia orgánica comestible en todo el mundo. El aumento de los rendimientos de semilla es un reto importante en la ciencia de las plantas.

Dado que las reservas de almacenamiento de semillas son fuentes de valor comercial de alimentos y materiales industriales, los mecanismos moleculares que subyacen a la regulación del metabolismo de estas reservas han sido ampliamente investigados 1-6. al aclarar más estos mecanismos será útil para aumentar el rendimiento de semilla en los cultivos. Las semillas se desarrollan en los ovarios después de la fertilización de las plantas, y que maduran a través de una serie de etapas de desarrollo 1,6,7. entender aún más el desarrollo de semillas mecanismo molecular subyacente requiere detallada, Perfiles de expresión génica precisas de una serie de semillas en desarrollo a ser producidos. Sin embargo, las altas cantidades de aceites, proteínas, hidratos de carbono, y los polifenoles en semillas de plantas hacen que sea difícil aislar ARN altamente purificada, que se opone a los perfiles precisa de la expresión génica.

Aquí, se introduce un método eficiente para el aislamiento de ARN a partir de las semillas oleaginosas que contienen grandes cantidades de aceites, proteínas y polifenoles. Usando este método, los investigadores podrán preparar ARN altamente purificada. Dicho ARN será útil para el seguimiento de los cambios en la transcripción de genes clave que controlan la regulación del metabolismo de las reservas de almacenamiento de semillas oleaginosas en el desarrollo y maduros.

Protocol

1. Extracción de ARN total de semillas de la planta Preparar conjuntos de tampones, columnas giratorias, 1.5 y 2.0 mL tubos de polipropileno, y tubos de polipropileno de 1,5 ml sin nucleasa. Añadir 1% (w / v) de polivinilpirrolidona de calidad para biología molecular (en lo sucesivo denominado PVP) a la celda tampón de lisis para la extracción de RNA y agitar vigorosamente. Incubar durante 20 min a 25 ° C para disolver completamente. Después de 20 min de incubación, mezclar el tampón suavem…

Representative Results

En primer lugar, se investigó la concentración óptima de PVP usando Arabidopsis semillas maduras. ARN total fue aislado de aproximadamente 1000 semillas de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente, utilizando tampón de lisis celular que contiene 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% o 2,0% de PVP. Después de la homogeneización y centrifugación, se recogió el sobrenadante evitando al mismo tiempo la capa de aceite y los residuos de la semilla (Figura 1A). <p c…

Discussion

los perfiles de expresión de genes contribuyen a nuestra comprensión de la fisiología de las plantas; Por lo tanto, los métodos de aislamiento de ARN específico se han desarrollado para cada condición de muestra 9-12. Se investigaron los procesos que se inhibe durante el aislamiento de ARN a partir de semillas y se ha encontrado que el ARN a membranas de sílice fue gravemente inhibida. Grandes cantidades de petróleo, proteínas y polifenoles inhiben el aislamiento de ARN. Hemos modificado el proceso d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al personal de la genómica funcional y Facility Fondo para espectrografía y Bioimagen, Nibb instalaciones centrales de la investigación y en un Centro de Investigación de Plantas Modelo, Nibb bio-Center.

Materials

RNeasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904
polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P5288-100G
HOMOGENIZER S-303 AS ONE 1-1133-02
NanoDrop Lite Thermo Scientific ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) TAKARA RR037A
KAPA SYBR Fast qPCR kit Kapa biosystems KK4601

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Cite This Article
Kanai, M., Mano, S., Nishimura, M. An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55008, doi:10.3791/55008 (2017).

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