وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على
Summary
We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.
Abstract
Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.
Introduction
النباتات تنتج البذور، والتي تؤدي إلى الجيل التالي. بذور تتراكم كميات كبيرة من احتياطيات تخزين، مثل الزيوت والكربوهيدرات، والبروتينات، للنمو بعد منتش. البشر الاستفادة من احتياطيات تخزين البذور كمصدر للتغذية الأغذية والأعلاف الحيوانية، وبالتالي بذور النباتات هي واحدة من الموردين الرئيسيين للمواد العضوية الصالحة للأكل في جميع أنحاء العالم. زيادة محصول البذور يشكل تحديا هاما في علم النبات.
منذ احتياطيات تخزين البذور هي مصادر ذات قيمة تجارية عالية من المواد الغذائية والمواد الصناعية، الآليات الجزيئية الكامنة وراء تنظيم عملية الأيض هذه الاحتياطيات تم التحقيق على نطاق واسع 1-6. وعلاوة على ذلك توضيح هذه الآليات يكون مفيدا لزيادة محصول البذور للمحاصيل. بذور تطور في المبايض المصنع بعد الإخصاب، وتنضج من خلال سلسلة من المراحل التنموية 1،6،7. فهم كذلك تطوير الآلية الجزيئية البذور الكامنة يتطلب تفصيلاودقيقة ملامح التعبير الجيني من سلسلة تطوير البذور التي يتم إنتاجها. ومع ذلك، فإن كميات كبيرة من الزيوت والبروتينات، والكربوهيدرات، ومادة البوليفينول في بذور النباتات تجعل من الصعب عزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء، والذي يحول دون التنميط دقيقة في التعبير الجيني.
هنا، ونحن نقدم وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي من البذور الزيتية التي تحتوي على كميات كبيرة من الزيوت والبروتينات ومادة البوليفينول. باستخدام هذه الطريقة، وسوف يقوم الباحثون أن يكون قادرا على إعداد RNA عالي النقاء. وهذا RNA يكون مفيدا لرصد التغيرات النسخي في الجينات الرئيسية السيطرة على تنظيم التمثيل الغذائي للاحتياطيات تخزين البذور في البلدان النامية والبذور الزيتية ناضجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تساهم ملامح التعبير الجيني في فهمنا لفسيولوجيا النبات. لذا، وضعت أساليب عزل الحمض النووي الريبي محددة لكل حالة عينة 9-12. نحن التحقيق في العمليات التي تحول دون خلال عزل الحمض النووي الريبي من البذور وجدت أن الحمض النووي الريبي ملزمة لأغشية السيليكا كانت تحول دون…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر موظفي مرفق الجينوم وظيفية والتصوير الطيفي وBioimaging مرفق، NIBB مرافق البحوث الأساسية، ومرفق نموذج بحوث النباتية، NIBB مركز Bioresource.
Materials
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
