Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse
Summary
We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.
Abstract
Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.
Introduction
Pflanzen produzieren Samen, die Anlass zu der nächsten Generation geben. Samen akkumulieren große Mengen an Speicherreserven, wie Öle, Kohlenhydrate und Proteine, für die post-germinative Wachstum. Die Menschen nutzen Samenspeicherreserven als Quellen für Lebens- und Futtermittel und damit Pflanzensamen sind eine der wichtigsten Lieferanten von essbaren organischen Stoffen weltweit. Samenerträge zu erhöhen, ist eine wichtige Herausforderung in der Pflanzenwissenschaft.
Da Reserven Samenspeicher kommerziell wertvolle Quellen für Lebensmittel und Industriematerialien sind, wurden 1-6 umfassend untersucht die molekularen Mechanismen der Regulation des Stoffwechsels dieser Reserven zu Grunde liegen. Ferner werden diese Mechanismen, welche zur Erhöhung der Samenerträge in Kulturen nützlich sein. Samen entwickeln sich in Pflanzen Ovarien nach der Befruchtung, und sie reifen durch eine Reihe von Entwicklungsstufen 1,6,7. Weiterhin die Entwicklung zugrunde liegenden Samen molekularen Mechanismus zu verstehen, erfordert eine detaillierte, Präzise Genexpressionsprofile von einer Reihe Samen der Entwicklung erzeugt werden. Allerdings sind die hohen Mengen an Ölen, Proteinen, Kohlenhydraten und Polyphenolen in Pflanzensamen machen es schwierig, hochgereinigter RNA zu isolieren, die eine exakte Profilierung der Genexpression verhindert.
Hier stellen wir ein effizientes Verfahren zur RNA-Isolierung aus Ölsaaten, die große Mengen an Ölen, Proteinen und Polyphenolen. Mit dieser Methode können die Forscher hoch gereinigter RNA herzustellen. Solche RNA wird zur Überwachung von Transkriptions Änderungen in Schlüsselgenen Steuerung der Stoffwechselregulation von Samenspeicherreserven in der Entwicklung und reifen Ölsaaten nützlich sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genexpressionsprofile tragen zum Verständnis der Pflanzenphysiologie; Daher wurden spezifische RNA – Isolierungsverfahren wurden für jede Probe Bedingung 9-12 entwickelt. Wir untersuchten die Prozesse, die während der RNA-Isolierung aus Samen gehemmt wurden und festgestellt, dass RNA zu Silikamembranen Bindung war stark gehemmt. Große Mengen an Öl, Proteine und Polyphenole hemmen RNA-Isolierung. Wir modifiziert, um die RNA-Extraktionsverfahren dieser Verbindungen mit einer Lyse-Lösung vor dem Proz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Personal von Functional Genomics Facility-und Spektrografie und Bioimaging-Anlage, Nibb Kernforschungsanlagen und Modellpflanze Research Facility, Nibb Bioresource-Center.
Materials
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
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