Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA'nın izolasyonu için etkili bir yöntem
Summary
We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.
Abstract
Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.
Introduction
Bitkiler nesil doğuran tohum üretmek. Tohumlar, post-germinatif büyüme yağlar, karbohidratlar ve proteinler gibi depolama rezervlerinin büyük miktarda birikir. İnsanlar gıda ve hayvan yemi kaynağı olarak tohum depolama rezervleri kullanmak ve böylece bitki tohumları dünya çapında yenilebilir organik maddenin önemli tedarikçilerinden biri vardır. tohum verimi artan bitki biliminde önemli bir sorundur.
Tohum depolama rezervleri gıda ve endüstriyel malzemelerin ticari olarak değerli kaynaklar olduğundan, bu rezervlerin metabolizmasının düzenlenmesine altında yatan moleküler mekanizmalar yaygın 1-6 incelenmiştir. Bundan başka, bu mekanizmaların tanıtılması bitkileri tohum verimini artırmak için yararlı olacaktır. Tohumlar Döllenmeden sonra bitki yumurtalıklarda gelişir ve bunlar gelişim aşamaları 1,6,7 bir dizi olgun. Dahası, moleküler mekanizma yatan tohum gelişimini anlamak detaylı gerektirirTohum geliştirme bir dizi hassas gen ekspresyon profillerini üretilecek. Ancak, bitki tohumlarında yağlar, proteinler, karbohidratlar, ve polifenoller yüksek miktarlarda zor sentezlenmesinin hassas profil önleyen yüksek ölçüde saflaştırılmış RNA izole etmek istiyorum.
Burada, sıvı yağlar, proteinler ve polifenoller büyük miktarlarda ihtiva eden yağlı tohumlardan RNA izolasyonu için etkili bir yöntem getirmektedir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar yüksek derecede arıtılmış RNA'nın hazırlanması mümkün olacaktır. RNA geliştirilmesi ve olgun yağlı tohumlar tohum depo edilen metabolik kontrol düzenlenmesi önemli genlerin transkripsiyonel değişikliklerin izlenmesi için yararlı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gen ekspresyon profilleri bitki fizyolojisinin anlayışımıza katkıda; Bu nedenle, belirli bir RNA izolasyon yöntemleri her bir örnek durum 9-12 geliştirilmiştir. Tohumları RNA izolasyonu sırasında inhibe ve RNA silika membranlanna bağlanan ölçüde inhibe olduğu bulundu işlemleri incelenmiştir. Yağ, proteinler ve polifenoller büyük miktarlarda RNA izolasyonu inhibe eder. Biz RNA silika membranların bağlanma işleminden önce bir parçalama solüsyonu ile bu bileşikleri kaldırmak için R…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz İşlevsel Genomik Tesisi ve spektrografisi ve Biyogörüntüleme Tesisi, NIBB Çekirdek Araştırma Hizmetleri ve Model Bitki Araştırma Tesisi, NIBB Bıoresource Merkezi'nin çalışanlarına teşekkür ederiz.
Materials
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
