Summary

L'isolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells

Published: February 06, 2017
doi:

Summary

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Abstract

La femmina tratto riproduttivo (FRT) mucosa sistema immunitario serve come la prima linea di difesa. Una migliore conoscenza della mucosa genitale è quindi essenziale per comprendere la patogenicità dei diversi agenti patogeni, tra cui l'HIV. Gamma Delta cellule (GD) T sono il prototipo delle cellule T "non convenzionali" e rappresentano una parte relativamente piccola sottogruppo di cellule T definite dalla loro espressione dei recettori delle cellule T eterodimeriche (TCR) composte da catene di gamma e delta. Questo li distingue dalle cellule T classici e molto meglio noti CD4 + helper e le cellule CD8 + T citotossici che sono definiti da TCR alfa-beta. cellule T GD spesso mostrano la localizzazione tessuto-specifica e sono arricchiti in epitelio. le cellule T GD orchestrare le risposte immunitarie a infiammazione, la sorveglianza del tumore, malattie infettive, e autoimmunità.

Qui, vi presentiamo un metodo per isolare ed analizzare riproducibile endocervicali intraepiteliale linfociti T GD umani. noi ettarove utilizzati campioni cytobrush endocervicali da donne che partecipano alle donne Interagency HIV Infection Study (WIHS). La conoscenza GD cellule T interazioni durante le condizioni in cui vi è un insulto alla mucosa vaginale potrebbe essere applicata a qualsiasi studio clinico in cui la vulnerabilità della mucosa è rivolta, compreso lo sviluppo di oltre microbicides.In vaginale, la conoscenza di risposte delle cellule della mucosa GD T ha possibilità di applicazione di GD T cell-based terapia immunitaria nel trattamento delle malattie infettive.

Introduction

Abbiamo sviluppato la metodologia di utilizzo di campioni endocervicali pennello per valutare le cellule T GD intraepiteliali. Il canale endocervicale è rivestito da un singolo strato di epitelio colonnare. Linfociti intraepiteliali rappresentano linfociti di prima linea che risiedono all'interno dello strato epiteliale che può rapidamente avviare risposte immunitarie su di incontrare microbi patogeni 7, 8. Comprendere gli eventi immunologici del vano intraepiteliale endocervicale è importante per la progettazione di strategie efficaci per prevenire le infezioni, compreso l'HIV.

Il nostro metodo può essere applicato per i campioni endocervicali umane appena raccolti, nonché le cellule endocervicali congelati per esplorare ulteriormente il ruolo delle cellule T GD intraepiteliale nelle donne con infezione da HIV o a rischio di infezione da HIV. L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di scoprire nuovi eventi immunologici nel vano intraepiteliale endocervicale e evaluatle risposte delle cellule T e GD come marker di vulnerabilità della mucosa nelle donne con infezione da HIV.

Le lacune sostanziali nella conoscenza intorno FGT immunità sono in parte a causa della difficoltà di raccolta e l'elaborazione dei campioni delle mucose con successo. Inoltre, il complesso eterogeneità delle cellule immunitarie mucosali, e la loro interconnessione tra loro, sono sfide importanti per identificare misurazioni clinicamente rilevanti che riflettono lo stato e la capacità del sistema immunitario. Abbiamo sviluppato un metodo per ottenere cellule altamente purificate intraepiteliali GD T che possono essere ulteriormente analizzate utilizzando altamente multiplex, tecnologie unicellulari che possono essere critiche per l'identificazione dei meccanismi alla base della FRT immunità.

Protocol

attività di studio ha avuto luogo presso l'Università di Unità di Ricerca HIV Miami, in collaborazione con l'HIV Interagency Studi delle Donne Miami (WIHS) e il Miami Center for AIDS Research (CFAR) .Institutional Review Board (Università di Miami Miller School of Medicine) l'approvazione è stata ottenuta prima per il reclutamento e le eventuali procedure di valutazione o di studio correlati. Raccolta del campione 1. endocervicale Brush NOTA: I par…

Representative Results

Recentemente, abbiamo analizzato intraepiteliale cellule T GD endocervicali e siamo stati il primo a riferire circa la perdita di cellule endocervicale T gamma delta in donne infette da HIV 9, 11. Qui, descriviamo il protocollo per isolare e analizzare il sottogruppo di cellule T gamma delta endocervicale. Come mostrato in figura 1, le cellule T GD possono essere facilmente rilevati nei campioni di cellule endoce…

Discussion

Valutazione della vulnerabilità femminile della mucosa del tratto genitale inferiore è una componente essenziale di studi clinici che affrontano il rischio di acquisizione e trasmissione del virus HIV. Tipicamente FGT vulnerabilità alle infezioni da HIV è valutata misurando immunomodulatori solubili nelle secrezioni genitali (citochine, chemochine e peptidi antimicrobici) 12, 13. Tuttavia, questi marcatori sono solo indicative di infiammazione vaginale, sono…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i partecipanti allo studio Miami WIHS per la loro disponibilità a partecipare a questo lavoro. I dati in questo manoscritto sono stati raccolti dalle donne Miami Interagency HIV Study (WIHS). I contenuti di questa pubblicazione sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano le posizioni ufficiali del National Institutes of Health (NIH). Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Allergy e Malattie infettive e Interagency HIV Infection Study femminile (WIHS) [concessione numero U01 AI103397], National Institute of Allergy e Malattie infettive, National Institutes of Health [codice di autorizzazione P30AI073961], Centro Nazionale per l'avanzamento traslazionale Scienze e l'Istituto nazionale sulla minoranza Salute e disparità, Istituto nazionale della Salute [codice di autorizzazione UL1TR000460 e 1KL2TR000461], e National Institute of Child Health e lo sviluppo umano, National Institute of Health [codice di autorizzazione K23HD074489].

Materials

Cytobrush Plus GT  (CareFusion, San Diego, CA, USA
IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium  ThermoFisher Scientific 12440061
Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer Beckman Coulter 496178
DMSO, Dimethyl sulfoxide  Sigma Aldrich  D2650
FBS, Fetal Bovine Serum Invitrogen, Gibco 26140-079
PBS Invitrogen, Gibco 10010023
BSA Sigma Aldrich A-9647
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit  Life Technologies, L349S9
1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich Sigma Aldrich  D6148
Fortessa flow cytometer  Becton Dickinson
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42
ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) Life Technologies A10346
anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit  Milteny Miltenyi Biotec Inc. 130-050-701
MS column 103-042-201
MACS separator 4124

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Cite This Article
Strbo, N., Romero, L., Alcaide, M., Fischl, M. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells. J. Vis. Exp. (120), e55038, doi:10.3791/55038 (2017).

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