Выделение и Flow Cytometric Анализ человеческого Endocervical Гамма-Дельта Т-клеток
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
Женского репродуктивного тракта (FRT) иммунная система слизистых оболочек служит в качестве первой линии обороны. Более глубокое понимание слизистой оболочки половых органов, поэтому необходимо для понимания патогенность различных патогенов, включая ВИЧ. Гамма-дельта (GD) Т-клетки являются прототипом «нетрадиционным» Т-клеток и представляют собой относительно небольшое подмножество Т-клеток, определяемых их экспрессии гетеродимерных рецепторов Т-клеток (TCR), состоящих из гамма и дельта цепей. Это отличает их от классических и гораздо более известных CD4 + Т – хелперов и CD8 + цитотоксических Т – клеток, которые определяются альфа-бета – ТКО. GD Т-клетки часто показывают локализацию тканеспецифичную и обогащены эпителия. GD Т-клетки оркестровать иммунные реакции воспаления, наблюдения опухоли, инфекционные болезни и аутоиммунитета.
Здесь мы представляем метод воспроизводимым выделять и анализировать человеческие эндоцервикальные интраэпителиальной GD Т-лимфоциты. Мы гаве использовали эндоцервикальные образцы цитощеточка от женщин, участвующих в женском инфекции исследовании Межведомственная ВИЧ (WIHS). Знание о GD взаимодействий Т-клеток во время условий, в которых есть оскорбление влагалища через слизистую оболочку может быть применен к любому клинического исследования, в которых адресуется через слизистую оболочку уязвимости, включая развитие вагинального microbicides.In Кроме того, знание о ответах через слизистую оболочку GD имеет Т-клеток потенциал для применения клеточной иммунотерапии GD T при лечении инфекционных заболеваний.
Introduction
Мы разработали методику использования эндоцервикальные образцов кисти для оценки интраэпителиальной GD Т-клеток. Эндоцервикальный канал выстланы однослойным цилиндрическим эпителием. Внутриэпителиальные лимфоциты представляют фронтовые лимфоциты , проживающих в пределах эпителиального слоя , который может быстро инициировать иммунный ответ при встрече с патогенными микробами 7, 8. Понимание иммунологических событий эндоцервикальной интраэпителиальной купе имеет важное значение для разработки эффективных стратегий для предотвращения инфекций, включая ВИЧ-инфекцию.
Наш метод может быть применен для свежесобранных эндоцервикса образцов человека, а также замороженных эндоцервикса клеток для дальнейшего изучения роли интраэпителиальных GD Т-клеток у женщин с ВИЧ-инфекцией или с высоким риском ВИЧ-инфекции. Основной целью данного протокола является выявление новых иммунологических событий в эндоцервикальной интраэпителиальной отсеке и evaluatклеточные ответы е GD T в качестве маркера уязвимости слизистых оболочек у женщин с ВИЧ-инфекцией.
Существенные пробелы в знаниях вокруг FGT иммунитета частично из-за трудностей в успешном сборе и обработке проб слизистых оболочек. Кроме того, комплекс гетерогенность слизистыми иммунных клеток, а также их взаимосвязанность друг с другом, являются основными проблемами для выявления клинически значимых измерений, которые отражают состояние и способность иммунной системы. Мы разработали метод получения высокоочищенных интраэпителиальной GD Т-клетки, которые могут быть дополнительно проанализированы с использованием высоко уплотненные, одноклеточные технологии, которые могут иметь решающее значение для определения механизмов, лежащих в основе FRT иммунитета.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оценка женских нижних половых путей уязвимости слизистой оболочки является важным компонентом клинических исследований, касающихся риска заражения и передачи ВИЧ-инфекции. Обычно FGT уязвимость по отношению к ВИЧ – инфекции оценивали путем измерения растворимых иммуномодуляторы в ге…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим участников исследования Майами WIHS за их готовность участвовать в этой работе. Данные в этой рукописи были собраны Межведомственной исследование ВИЧ Майами женщин (WIHS). Содержание данной публикации является исключительной ответственностью авторов и не отражают официальную точку зрения Национального института здоровья (NIH). Эта работа была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний и женского инфекционного исследования Межведомственная ВИЧ (WIHS) [грант номер U01 AI103397], Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения [номер гранта P30AI073961], Национальный центр Выросшие трансляционные наук и Национальный институт по проблемам здоровья меньшинств и здравоохранения диспаритета, Национальный институт здравоохранения [номер гранта UL1TR000460 и 1KL2TR000461] и Национальный институт здоровья ребенка и развития человека, Национальный институт здравоохранения [номер гранта K23HD074489].
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
