العزلة وتدفق Cytometric تحليل الإنسان باطن عنق الرحم غاما دلتا الخلايا التائية
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
يقدم الجهاز التناسلي (FRT) الغشاء المخاطي الجهاز المناعي الإناث كنسبة خط الدفاع الأول. معرفة أفضل من الغشاء المخاطي التناسلية هي بالتالي أساسية لفهم المرضية لمسببات الأمراض المختلفة بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية. دلتا غاما الخلايا (GD) T هي نموذج لخلايا T 'غير تقليدية' وتمثل مجموعة فرعية صغيرة نسبيا من الخلايا التائية التي يحددها التعبير عنها من مستقبلات الخلايا التائية heterodimeric (TCRs) تتألف من جاما ودلتا سلاسل. هذا يفرقهم من CD4 + الخلايا التائية المساعدة الكلاسيكية والكثير المعروف والخلايا CD8 + التائية السامة التي تم تعريفها من قبل TCRs ألفا بيتا. غالبا ما تظهر خلايا GD تي توطين أنسجة محددة ويتم إثراء في ظهارة. خلايا GD تي تنسق الاستجابات المناعية في التهاب والمراقبة الورم، والأمراض المعدية، وأمراض المناعة الذاتية.
هنا، فإننا نقدم وسيلة لعزل بتكاثر وتحليل باطن عنق الرحم داخل الظهاري الخلايا الليمفاوية T GD الإنسان. نحن هالقد استخدمت عينات cytobrush باطن عنق الرحم من النساء المشاركات في المرأة العدوى دراسة مشتركة بين فيروس نقص المناعة البشرية (WIHS). المعرفة حول GD خلايا تي التفاعل خلال الظروف التي يوجد فيها إهانة للالغشاء المخاطي المهبلي يمكن تطبيقها على أي دراسة سريرية التي يتم فيها معالجة الضعف المخاطية، بما في ذلك تطوير بالإضافة microbicides.In المهبلية والمعرفة حول استجابات الخلايا المخاطية GD تي ديها إمكانية تطبيق GD تي خلية القاعدة العلاج المناعي في علاج الأمراض المعدية.
Introduction
قمنا بتطوير منهجية باستخدام عينات من باطن عنق الرحم فرشاة لتقييم خلايا GD T داخل الظهاري. واصطف قناة باطن عنق الرحم بواسطة طبقة واحدة من ظهارة عمودية. تمثل الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري الخلايا الليمفاوية خط المواجهة المقيمين داخل الطبقة الظهارية التي يمكن الشروع في الاستجابات المناعية على مواجهة الميكروبات المسببة للأمراض 7 و 8. فهم الأحداث المناعية من حجرة داخل الظهاري باطن عنق الرحم المهم لتصميم استراتيجيات فعالة لمنع العدوى، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية.
ويمكن تطبيق أسلوبنا لعينات من باطن عنق الرحم البشري التي جمعت حديثا وكذلك خلايا باطن عنق الرحم المجمدة لمواصلة استكشاف دور خلايا GD T داخل الظهاري في النساء بفيروس نقص المناعة البشرية أو المعرضين لخطر الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو اكتشاف الأحداث المناعية جديدة في حجرة داخل الظهاري باطن عنق الرحم وevaluatاستجابات الخلايا ه GD تي كعلامة ضعف الغشاء المخاطي في النساء بفيروس نقص المناعة البشرية.
ومن المقرر جزئيا إلى صعوبة في جمع ومعالجة عينات المخاطية بنجاح ثغرات كبيرة في المعرفة حول الحصانة FGT. وعلاوة على ذلك، عدم تجانس معقدة من الخلايا المناعية المخاطية، وترابطها مع بعضها البعض، تحديات كبرى لتحديد القياسات ذات الصلة سريريا التي تعبر عن الدولة وقدرة الجهاز المناعي. قمنا بتطوير طريقة للحصول على خلايا داخل الظهاري العالية النقاء GD T يمكن أن يكون أبعد تحليلها باستخدام المضاعفة العالية والتقنيات وحيدة الخلية التي قد تكون حاسمة لتحديد الآليات الكامنة وراء الحصانة FRT.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقييم أقل التناسلية ضعف الجهاز المخاطي الإناث هو عنصر أساسي من الدراسات السريرية معالجة مخاطر اكتساب فيروس نقص المناعة البشرية وانتقال العدوى. وعادة ما يتم تقييم FGT التعرض للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق قياس جهري المناعي للذوبان في الإفرازات التناسلية (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المشاركين في الدراسة ميامي WIHS عن استعدادهم للمشاركة في هذا العمل. وقد تم جمع البيانات في هذه المخطوطة من قبل النساء في ميامي دراسة فيروس نقص المناعة البشرية بين الوكالات (WIHS). محتويات هذا المنشور هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن المؤلفين ولا تمثل وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة (NIH). وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية ودراسة العدوى بين الوكالات فيروس نقص المناعة البشرية نسائية (WIHS) [منح عدد U01 AI103397]، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والمعاهد الوطنية للصحة [عدد المنح P30AI073961]، المركز الوطني للنهوض العلوم بالحركة والمعهد الوطني لصحة الأقليات والصحة الفوارق، المعهد الوطني للصحة [عدد المنح UL1TR000460 و1KL2TR000461]، والمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، المعهد الوطني للصحة [عدد المنح K23HD074489].
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
