人类宫颈的γδT细胞的分离和流式细胞仪分析
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
女性生殖道（FRT）粘膜免疫系统作为防御的第一道防线。生殖器粘膜更好地了解因此对于理解不同的病原体，包括病毒的致病性是必不可少的。伽马增量（GD）T细胞是“非常规的”T细胞的原型，并代表其γ和δ链组成的异二聚体T细胞受体（TCR）的表达定义的T细胞的相对小的子集。此它们区别于由α-β的TCR限定的经典和更好的已知CD4 +辅助T细胞和CD8 +细胞毒性T细胞。 GD T细胞常表现出组织特异性定位及上皮充实。 GD T细胞协调在炎症，肿瘤监视，感染性疾病，和自身免疫的免疫应答。
在这里，我们提出可重复分离和分析人的子宫颈上皮内GD T淋巴细胞的方法。我们公顷从已经参加的女性妇女间HIV感染研究（WIHS）中使用的宫颈细胞刷样本。在条件有关GD T细胞相互作用的知识，其中有侮辱了阴道粘膜可应用于任何临床研究中，粘膜漏洞被解决，包括阴道microbicides.In另外的发展，对粘膜GD T细胞应答的知识有潜力在治疗感染性疾病的应用GD牛逼细胞为基础的免疫疗法。
Introduction
我们开发使用宫颈刷样本，以评估上皮内GD T细胞的方法。宫颈管被柱状上皮单层衬里。上皮内淋巴细胞代表驻留在上皮细胞层内前线淋巴细胞，可以迅速地在遇到病原微生物7,8引发免疫反应。了解宫颈上皮内舱的免疫活动是有效的战略设计，以防止伤口感染，包括艾滋病毒非常重要的。
我们的方法可应用于新鲜收集的人类宫颈样品以及冷冻颈管细胞进一步探索上皮内GD T细胞的妇女感染艾滋病毒或感染艾滋病风险的作用。该协议的主要目标是发现新的免疫活动在宫颈上皮内舱，以及evaluatËGD T细胞应答粘膜脆弱的妇女感染艾滋病毒的标志。
在周围FGT免疫知识的大量间隙部分是由于难以在成功地收集和处理的粘膜样品。此外，粘膜免疫细胞的复杂的异质性，以及它们与彼此相互联系，都是以确定反映免疫系统的状态和能力临床相关的测量的主要挑战。我们开发了一种方法，以获得高度纯化的上皮内GD的T细胞，可以进一步使用可用于识别的FRT免疫力的基本机制临界高度多路复用，单细胞的技术进行分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
女性下生殖道粘膜脆弱性评价是临床研究解决艾滋病毒的采集和传播风险的重要组成部分。通常情况下FGT感染艾滋病毒是由生殖器分泌物（细胞因子，趋化因子和抗菌肽）12，13测量可溶性免疫调节剂进行评估。然而，这些生物标志物只是象征性阴道炎症，由生理和病理的事件受到影响，而且并不总是代表直接粘膜损伤。为了提高我们的粘膜因素如何增?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢迈阿密WIHS研究的参与者为自己愿意参加这项工作。在这个手稿的数据是由迈阿密妇女间艾滋病毒研究（WIHS）收集。本出版物的内容完全是作者的责任，并不代表美国国立卫生研究院（NIH）的官方意见。这项工作是由过敏和传染病研究所和妇女间的艾滋病毒感染的研究（WIHS）的授权号U01 AI103397]，国家过敏和传染病研究所，卫生部[基金号P30AI073961]的国家机构，国家中心推进支持生转化科学与健康[授权编号UL1TR000460和1KL2TR000461]研究所国立少数民族健康与健康差距，与儿童健康和人类发展研究所研究院[授权号码K23HD074489。
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
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