Isolatie en Flow cytometrische analyse van Human Endocervicale Gamma Delta T-cellen
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
Het vrouwelijke voortplantingssysteem (FRT) mucosale afweersysteem dient als eerste verdedigingslinie. Betere kennis van de genitale slijmvliezen is daarom van essentieel belang voor het begrijpen van pathogeniciteit van verschillende ziekteverwekkers, waaronder HIV. Gamma'sdelta (GD) T-cellen zijn het prototype van onconventionele T cellen en vormen een relatief kleine subgroep van T-cellen gedefinieerd door hun expressie van heterodimere T-celreceptoren (TCR's) uit gamma- en delta ketens. Dit onderscheidt hen van de klassieke en nog beter bekend CD4 + helper T-cellen en CD8 + cytotoxische T-cellen die worden gedefinieerd door alfa-beta TCRs. GD T-cellen hebben vaak weefselspecifieke lokalisatie en verrijkt in epitheel. GD T-cellen orkestreren immuunresponsen bij ontsteking, tumor surveillance, infectieziekten en auto-immuniteit.
Hier presenteren we een methode reproduceerbaar isoleren en analyseren menselijke endocervicale intraepitheliale GD T-lymfocyten. we have gebruikt endocervicaal Cytobrush monsters van vrouwen die deelnemen aan de Women's Interagency HIV-infectie Study (WIHS). Kennis over GD T cellen interacties tijdens omstandigheden waarin er een belediging voor de vaginale mucosale kan worden toegepast op elk klinisch onderzoek waarbij mucosale kwetsbaarheid is gericht, inclusief de ontwikkeling van vaginale microbicides.In Bovendien kennis mucosale GD T celresponsen heeft toepassingspotentieel GD T-cellen gebaseerde immuuntherapie bij de behandeling van infectieziekten.
Introduction
We ontwikkelden methode waarbij endocervicale borstel monsters intraepithelial GD T-cellen te evalueren. De endocervicaal kanaal is bekleed met een enkele laag van cilinderepitheel. Intra-epitheliale lymfocyten vertegenwoordigen frontlinie lymfocyten die woonachtig zijn binnen de epitheellaag die snel immuunreacties kunnen initiëren op het ontmoeten van pathogene micro-organismen 7, 8. Inzicht in de immunologische gebeurtenissen van endocervicale intra-epitheliale compartiment is belangrijk voor de ontwikkeling van effectieve strategieën voor infecties, waaronder HIV.
De methode kan worden toegepast vers verzameld menselijk endocervicale monsters en ingevroren endocervicale cellen de rol van intra-epitheliale GD T-cellen bij vrouwen met HIV-infectie of het risico loopt HIV-infectie verder te onderzoeken. Het belangrijkste doel van dit protocol is om nieuwe immunologische gebeurtenissen ontdekken in endocervicaal intraepithelial compartiment en evaluate GD T-cel responsen als een marker van mucosale kwetsbaarheid bij vrouwen met HIV-infectie.
De aanzienlijke lacunes in de kennis rond FGT immuniteit zijn deels te wijten aan de moeilijkheid in het succesvol verzamelen en verwerken van mucosale monsters. Bovendien is de complexe heterogeniteit van mucosale immune cellen en hun onderlinge verbondenheid met elkaar, zijn belangrijke uitdagingen voor klinisch relevante identificeren die de toestand en het vermogen van het immuunsysteem weerspiegelen. We ontwikkelden een methode om zeer gezuiverd intraepithelial GD T-cellen die verder kunnen worden geanalyseerd met behulp sterk gemultiplexeerde, eencellig technologieën die kritiek zijn voor het identificeren van de onderliggende mechanismen van FRT immuniteit kan verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evaluatie van de vrouwelijke geslachtsorganen lagere slijmvlies kwetsbaarheid is een essentieel onderdeel van de klinische onderzoeken naar het risico van HIV acquisitie en transmissie. Typisch FGT gevoeligheid voor HIV-infectie wordt geëvalueerd door het meten van oplosbare immunomodulatoren in genitale afscheidingen (cytokinen, chemokinen en antimicrobiële peptiden) 12, 13. Echter, deze biomarkers zijn slechts een indicatie van de vaginale ontsteking, worden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de Miami WIHS studie deelnemers voor hun bereidheid om deel te nemen aan dit werk. De gegevens in dit manuscript werden verzameld door de Miami Women's Interagency HIV Study (WIHS). De inhoud van deze publicatie zijn uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet de officiële standpunten van de National Institutes of Health (NIH) te vertegenwoordigen. Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten en Women's Interagency HIV-infectie Study (WIHS) [subsidie nummer U01 AI103397], Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten, National Institutes of Health [subsidie nummer P30AI073961], National Center for Advancing Translationeel Wetenschappen en het Nationaal Instituut voor Minority Health and Health verschillen, National Institute of Health [subsidie nummer UL1TR000460 en 1KL2TR000461], en het National Institute of Child Health and Human Development, National Institute of Health [subsidie nummer K23HD074489].
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
