Abstract
الجذعية الوسيطة / الخلايا اللحمية (اللجان الدائمة) على وعود كبيرة في الهندسة الحيوية والطب التجديدي. اللجان الدائمة يمكن عزلها عن أنسجة البالغين متعددة عبر الالتزام القوي للالبلاستيك زراعة الأنسجة ومن ثم مزيد من التوسع في المختبر، والأكثر شيوعا باستخدام مصل بقري جنيني (FBS). منذ FBS يمكن أن يسبب اللجان الدائمة لتصبح مناعة، وجودها في الثقافات MSC يحد كلا التطبيقات السريرية والتجريبية من الخلايا. لذلك، دراسات توظيف تعريف كيميائيا (XF) وسائل الاعلام خالية من XENO للثقافات MSC قيمة للغاية. وقد أرجع العديد من الآثار المفيدة للاللجان الدائمة لقدرتها على تنظيم الالتهاب والمناعة، وذلك أساسا من خلال إفراز العوامل المناعية مثل نخر الورم حفز عامل الجينات 6 (TSG6) والبروستاغلاندين E2 (PGE2). ومع ذلك، اللجان الدائمة تتطلب تفعيل لإنتاج هذه العوامل ومنذ أثر من اللجان الدائمة في كثير من الأحيان عابرة، برز اهتمام كبير لاكتشاف طرق من قبل تنشيط خلايا PRIOr لاستخدامها، وبالتالي القضاء على الوقت الضائع لالتنشيط في الجسم الحي. هنا نقدم بروتوكولات لتفعيل كفاءة أو اللجان الدائمة الرئيسية في ثلاثي الأبعاد (3D) الثقافات في ظل ظروف XF محددة كيميائيا وإدارة هذه اللجان الدائمة تفعيلها مسبقا في الجسم الحي. على وجه التحديد، وصفنا أولا طرق لتوليد MSC كروية الأنسجة الصغيرة أو "الكروية" في شنقا قطرات باستخدام XF المتوسطة وشرح كيفية المجالات والمتوسطة مكيفة (CM) يمكن حصاده لمختلف التطبيقات. ثانيا، نحن تصف شاشات التعبير الجيني في المختبر المقايسات الفنية لتقييم بسرعة على مستوى تفعيل لجنة السلامة البحرية في الكروية، مع التركيز على إمكانات المضادة للالتهابات ومضاد للسرطان من خلايا. ثالثا، نحن تصف طريقة رواية لحقن الكروية MSC سليمة في التجويف البريتوني الماوس في الجسم الحي اختبار فعالية. وعموما، فإن البروتوكولات التغلب على هذه الوثيقة التحديات الكبرى للحصول على اللجان الدائمة تفعيلها مسبقا تحت تعريف كيميائيا يخدع XFditions وتوفر نظاما مرنا لإدارة الكروية MSC للعلاج.
Introduction
وقد أظهرت الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة (اللجان الدائمة) إمكانات كبيرة لمختلف النهج الطب التجديدي. تم عزل اللجان الدائمة في البداية باعتبارها عنصرا انسجة نخاع العظام ولكن تم الحصول عليها منذ من العديد من أنسجة البالغين الأخرى، بما في ذلك الأنسجة الدهنية 1، 2، 3. ومن المثير للاهتمام، تحتضن طريقة العزلة الرئيسي خاصية رائعة من اللجان الدائمة التمسك بإحكام على البلاستيك زراعة الأنسجة في وجود مصل بقري جنيني (FBS). بينما تسمح هذه التقنية العزلة التقليدية التوسع السهل والسريع من اللجان الدائمة في ثنائية الأبعاد (2D) ثقافة، بل هو أيضا الاصطناعي للغاية ويتجاهل أهمية البيئة المحلية ثلاثي الأبعاد (3D) مما أدى إلى خسارة محتملة من الخصائص الخلوية مهمة 4، 5 (6). ولذلك، فإن دراسة اللجان الدائمة في الثقافات 3D، التيأكثر الفسيولوجية من الثقافات 2D التقليدية، ظهرت في البحث عن خصائص MSC "فقدت / تقلص". وعلاوة على ذلك، ارتفع اهتماما كبيرا لتحديد الشروط (XF) خالية من XENO محددة كيميائيا للثقافة MSC والتنشيط، وبالتالي تجعل الخلايا أكثر تقبلا للتطبيقات السريرية.
وقد نشرت العديد من الدراسات يدل على ثقافة 3D من اللجان الدائمة في كل من المواد الحيوية وكما الركام كروية أو الكروية. وقد صممت اللجان الدائمة في المواد الحيوية في البداية لنهج هندسة الأنسجة لاستبدال الأنسجة التالفة مع السقالات خلية المصنفة، في حين شوهدت الثقافات كروي من اللجان الدائمة وسيلة لفهم السلوك MSC في الجسم الحي بعد تناوله من الخلايا للعلاج في التجارب ما قبل السريرية أو الإكلينيكية 4 و 5 و 7. ومن المثير للاهتمام، اللجان الدائمة شكل الكروية بشكل عفوي عندما التمسك البلاستيك زراعة الأنسجة غير مسموح8، 9، 10. تقليديا، تم تسهيل تجميع الخلية عن طريق أساليب قارورة الدوار أو تقنيات تراكب السائلة وطرق استخدامها في البداية في بيولوجيا السرطان في جهود محاولة لتقليد المكروية الورم. وفي الآونة الأخيرة، ظهرت طرق إضافية التي تثبت تجميع الخلايا في أطباق ثقافة ما قبل المغلفة بمواد كيميائية محددة لمنع الخلية الى البلاستيك التصاق 4، 5، 6. واحد من أبسط وأكثر اقتصادا وسائل لتوليد الأجسام الشبه الكروية MSC هو ثقافة لهم في شنقا قطرات، وهي تقنية تستخدم غالبا للإنتاج الهيئات مضغي من الخلايا الجذعية الجنينية. مع شنقا تقنية ثقافة الإفلات، يتم منع التقيد الخلية إلى البلاستيك زراعة الأنسجة من خلال تعليق الخلايا في قطرة من المتوسط على الجانب السفلي من غطاء الأنسجة صحن الثقافة والسماح خطورة لتسهيل aggreg خليةأوجه في قمة الهبوط. حجم كروي يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير تركيز الخلية أو حجم الانخفاض، مما يجعل انخفاض الثقافات شنقا سهلة جدا السيطرة.
أظهرت الدراسات المبكرة على الثقافة 3D من اللجان الدائمة اختلافات جذرية في خصائص الخلايا في 3D مقارنة مع نظرائهم 2D 6، 8، 9. وفي الوقت نفسه، أظهرت التقارير أن التأثيرات المفيدة للاللجان الدائمة في الجسم الحي تعتمد على قدرتها على أن تصبح تفعيلها من خلال الاشارات الصغيرة البيئية، وردا على ذلك، لإنتاج المضادة للالتهابات والمناعية عوامل 11. ومن المثير للاهتمام، تم إنتاج العديد من هذه العوامل مثل البروستاغلاندين E2 (PGE2)، نخر الورم حفز عامل الجينات 6 (TSG6)، وعامل النمو الكبدية (HGF) بكميات أكبر بكثير من الكروية MSC من اللجان الدائمة 2D التقليدية مما يمهد الطريق ل فكرة عناستخدام الثقافات 3D لتنشيط الخلايا 8 و 12 و 13. وعلاوة على ذلك، يبدو تفعيل الجين في الثقافات 3D لألخص الآليات، على الأقل جزئيا، من تنشيط الخلايا بعد حقن الفئران إلى 12. من خلال تفعيل اللجان الدائمة السابقة لاستخدامها في التجارب، والآثار المترتبة على خلايا يمكن أن تكون طويلة وأكثر بروزا في كثير من الأحيان يتم تأخير تأثير MSC التقليدي في الجسم الحي وعابرة، ويمكن وصفها بأنها "الكر والفر". خلال السنوات العديدة الماضية، وقد أثبتت الدراسات وظيفية هامة باستخدام الكروية MSC يتمكنوا من قمع الاستجابات الالتهابية وتعدل مناعة في الجسم الحي من خلال التأثير على الخلايا المستجيب مثل الضامة، والخلايا الجذعية، العدلات، والخلايا T جعل الكروية وشكل جذاب من اللجان الدائمة تستعد 2 3. وبالإضافة إلى ذلك، إنتاج جزيئات مضادة للسرطان، مثل كثافة العملياتerleukin 24 (IL-24)، ونخر الورم المتعلقة عامل يحفز الخلايا يجند (تريل)، وزاد في الثقافات 3D من اللجان الدائمة بالنسبة للأحادي الطبقة اللجان الدائمة، وهي الظاهرة التي يمكن استغلالها لعلاجات السرطان تستهدف 8 و 10 و 14.
وبما أن الثقافة لجنة السلامة البحرية التقليدية تتطلب ليس فقط استخدام البلاستيك زراعة الأنسجة ولكن أيضا FBS، عقبة أخرى لجعل الكروية MSC أكثر قابلية للاستخدام السريري كان لا بد من التغلب عليها. لمعالجة هذه العقبة، وأظهرت مؤخرا تشكيل الكروية MSC في ظل ظروف محددة XF محددة كيميائيا وأثبت أن الكروية MSC مما أدى تم تفعيلها لإنتاج نفس الجزيئات المضادة للالتهابات ومضادة للسرطان حيث الكروية ولدت في ظروف مع FBS 14. هنا، يتم عرض هذه النتائج في عدة بروتوكولات وإجراءات تفصيلية التي تبرهن على جيل من اللجان الدائمة تفعيلها مسبقا في الثقافات 3D باستخدام XFوسائل الإعلام. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عرض البروتوكولات التي تصف طرق فعالة لتقييم مستويات تفعيل اللجان الدائمة في ما يخص المضادة للالتهابات، المناعية والمضادة للسرطان آثارها، جنبا إلى جنب مع وسيلة عملية لتقديم الكروية سليمة في الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل MSC والتوسع
- الحصول على اللجان الدائمة مرور وقت مبكر من مركز إعداد وتوزيع الخلايا الجذعية البالغة ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) 15 قارورة كما المجمدة. بدلا من ذلك، عزل اللجان الدائمة من aspirates نخاع العظم بعد بروتوكول روتيني 14 وتخزين قوارير كما المجمدة.
- إعداد مستنبت الكامل (CCM)، وهو الحد الأدنى ألفا المتوسط الأساسية (αMEM) تستكمل مع 15-20٪ قسط تحديد FBS، 2 مم L-الجلوتامين، و1X البنسلين ستربتومايسين. تعقيم المتوسطة عن طريق الترشيح.
- ضع 30 مل من CCM في طبق خلية ثقافة 150 ملم واحتضان الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
- احتضان القارورة المجمدة تحتوي على ما يقرب من 10 6 اللجان الدائمة لمدة 2 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
- نقل محتويات القارورة إلى الطبق الثقافة باستخدام الماصة 5 مل المصلية ويغسل عدة مرات قنينة مع 1-2 مل CCM من طبق لالتقاط الخلايا المتبقية. ضع بين عشية وضحاها الطبق في حاضنة مناسبة.
- تغسل بعناية الثقافة مرتين مع درجة حرارة الغرفة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وفصل اللجان الدائمة مع 3 مل من / ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) حل 0.25٪ التربسين قبل تحسنت. مفرزة عادة ما يستغرق حوالي 3-4 دقيقة في الحاضنة.
- تحييد التربسين في صحن مع 6 مل CCM قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية، ونقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل. تتحد مع يغسل من برنامج تلفزيوني لتعظيم العائد الخلية.
- الطرد المركزي الخلايا (450 x ج) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف.
- إعادة تعليق الخلايا في كمية صغيرة من CCM وعد خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات والأزرق التريبان.
- البذور عدد مناسب من الأطباق 150 ملم في 100 خلية / سم 2
- حصاد الخلايا على النحو الوارد أعلاه مع التربسين / EDTA والجمع بين جميع خلايا في أنبوب مخروطي الشكل واحد مع وسيلة مناسبة. الطرد المركزي مرة أخرى وإعادة تعليق الخلايا في كمية صغيرة من نفس المتوسطة لعدد الخلايا. استخدام CCM القياسية (التي تحتوي على FBS) أو المختلفة المتاحة تجاريا XF التركيبات وسائل الإعلام، ويشار هنا إلى أنه XF المتوسطة 1 (XFM-1) وXF المتوسطة 2 (XFM-2)، مع وبدون ألبومين المصل البشري (HSA، 13 ملغ / مل) مكملات.
2. إعداد المنشط MSC الأجسام الشبه الكروية في 3-D شنقا الثقافات قطرة تحت ظروف XF
- لتوليد الأجسام الشبه الكروية من حوالي 25،000 الخلايا، يخفف من اللجان الدائمة التي تحصد في CCM، XFM-1، XFM-1 + HSA (13 ملغ / مل)، XFM-2، أو XFM-2 + HSA (13 ملغ / مل) في 714 الخلايا / ميكرولتر.
- ماصة 35 ميكرولتر / قطرات من الخلايا علىالجانب السفلي من 150 ملم ثقافة المقلوب طبق غطاء. قطرات متعددة يمكن pipetted بسهولة باستخدام ماصة الأقنية.
ملاحظة: إذا رغبت الكروية أكبر أو أصغر، تغيير تركيز الخلية أو حجم الانخفاض (25-45 ميكرولتر) بشكل مناسب. - نقل 20 مل من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني في قاعدة الطبق وفي حركة مستمرة وثابتة واحدة الوجه الغطاء، الذي يحتوي على قطرات، حتى أن قمم انخفاض تواجه الهبوط. وضع غطاء بعناية على قاعدة الطبق الثقافة.
- نقل الطبق في الحاضنة لمدة 3 أيام من دون إزعاج ذلك للسماح التجمع المجال المناسب.
- بعد 72 ساعة، يبدأ الحصاد كروي عن طريق إزالة الغطاء بعناية وعكس ذلك بحيث قطرات، مرة أخرى، تواجه التصاعدي.
- زاوية الغطاء لحوالي 10-20 درجة، ودفع قطرات، التي تحتوي على الكروية، إلى حافة صفيحة باستخدام رافع الخلية.
- نقل المجالات والمتوسطة في أنبوب مخروطي 15 مل مع أنبوب 1000 ميكرولترتتي. استخدام درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني وماصة مع نفس الطرف لغسل لوحة وضمان استرداد الحد الأقصى من الكروية.
- في الوقت الحقيقي المقايسات PCR (بروتوكول 3)، الطرد المركزي تعليق المجال في 450 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف. غسل الكروية مع برنامج تلفزيوني وكرر كل من الطرد المركزي والطموح الخطوات. للتسليم في الحيوانات (بروتوكول 8)، والسماح المجالات ليستقر في قاع الأنبوب (~ 3-4 دقيقة) دون الطرد المركزي.
3. في الوقت الحقيقي PCR من علامات المضادة للالتهابات ومضاد للسرطان
- استخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي مع الأعمدة الخالط ومجموعة الدناز ريبونوكلياز خالية لعزل الحمض النووي الريبي خالية من الحمض النووي الكلي من اللجان الدائمة أحادي الطبقة (بروتوكول 1) والكروية MSC (بروتوكول 2) التي تم غسلها مع برنامج تلفزيوني وطرد.
- ليز لا يقل عن 100،000 اللجان الدائمة أحادي الطبقة و 20 الكروية من كل شرط في منفصلة أنابيب مخروطية 15 مل مع العازلة RLT تحتوي على β-المركابتويثانول (1: 100).
- عبرفر ولست] مختلطة تماما في أنابيب 1.5 مل ريبونوكلياز حرة ووضع في الثلاجة (-80 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 3 ساعة للمساعدة في تحلل كروي.
- ذوبان الجليد في الخلية لست] على الجليد، دوامة لفترة وجيزة، واتبع تعليمات الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي باستخدام المتاحة تجاريا الثدييات مجموع عدة RNA العزلة.
- قياس وتقييم جودة من الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
- استخدام عالية السعة كدنا] النسخ العكسي كيت أو ما يعادلها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لتوليد كدنا] في الوقت الحقيقي PCR.
- وضع عينات كدنا]، تصميم تجاريا في الوقت الحقيقي الاشعال PCR / المسابير (فحوصات الجينات)، وPCR ميكس ماستر على الجليد. استخدام بادئات / تحقيقات لGAPDH (السيطرة)، PTGS2 (COX-2، المضادة للالتهابات)، TNFAIP6 (TSG6، المضادة للالتهابات)، TRAIL (المضادة للسرطان)، و IL-24 (المضادة للسرطان).
- إعداد الوقت الحقيقي تفاعلات PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة للفحوصات الجينات وUnive السريعrsal ميكس ماستر.
- اتبع الإرشادات لفي الوقت الحقيقي PCR أداة لتوليد الوثائق تجربة وأداء التشغيل.
- تحليل البيانات باستخدام طريقة ΔΔC T عن طريق حساب التغيرات النسبية (كمية النسبية، RQ) في التعبير الجيني باستخدام GAPDH، والتحكم وأحادي الطبقة من اللجان الدائمة المحلية كأساس 8 و 14.
4. جمع CM لفحوصات من المناعية ومكافحة السرطان المحتملة
- حصاد الكروية وسم كما هو موضح أعلاه في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، وذلك باستخدام رافع الخلية وماصة، ومع ذلك، لا يغسل الأغطية الطبق مع برنامج تلفزيوني حيث سيؤدي ذلك إلى إضعاف سم.
- أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وجمع بعناية طاف خالية من الخلايا مع ماصة، ونقل طاف في أنابيب 1.5 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وجمع بعناية البنودCM arified مع ماصة، ونقل سم في الجديدة 1.5 مل أنابيب لتخزين في الثلاجة (-80 درجة مئوية). إعداد aliquots من مجلس الوزراء قبل التجميد عند استخدامه لفحوصات متعددة.
ملاحظة: قبل إجراء المقايسات المصب، PGE2 تركيز، وهو مؤشر جيد للإمكانات المضادة للالتهابات من سم، ويمكن تحديد باستخدام طقم ELISA التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تركيز TSG6 يمكن تحديد باستخدام بروتوكول نشر 14.
5. بلعم الفحص لتقييم إمكانات المضادة للالتهابات من MSC-CM
- إعداد المتوسطة بلعم، والذي يتألف من المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) التي تحتوي على L-ألانيل-L-الجلوتامين وتستكمل مع 10٪ قسط تحديد FBS و1X البنسلين ستربتومايسين. تصفية تعقيم المتوسطة.
- الحصول على قارورة المجمدة الضامة الماوس ما يقرب من 10 6 J774 واحتضان القارورة لمدة 2 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
- نضح طاف، تعليق الضامة في 1 مل من المتوسط بلعم، ونقل الضامة إلى 150 مم طبق بتري تحتوي على 30 مل من المتوسط بلعم.
- تغيير المتوسطة كل أيام 2 و احتضان الخلايا في الحاضنة حتى ما يقرب من 70-80٪ متموجة.
ملاحظة: الضامة لا تلتزم بإحكام على طبق بتري، وبالتالي ينبغي الحرص على عدم فقدان الخلايا مع تغيير المتوسطة. - حصاد الضامة عن طريق الرش المتوسط بلعم على الخلايا مع ماصة. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 200-300 x ج ودرجة حرارة الغرفة.
- نضح طاف وتعليق الخلايا في كمية صغيرة من متوسطة بلعم لعدد الخلايا مع عدادة الكريات. ضبط تركيز إلى 200000 خلية / مل مع البلاعم ليdium.
- لبدء انشاء لفحص بلعم، إضافة 480 ميكرولتر من المتوسطة بلعم في آبار من لوحة ال 12 أيضا.
- إضافة 20 ميكرولتر من المتوسطة بلعم في الآبار غير حفز تحكم و 20 ميكرولتر من غير مكيفة أو مكيفة MSC-المتوسطة، أعدت أعلاه، في الآبار التجريبية. خلط المتوسطة في الآبار عن طريق النقر على لوحة.
- نقل 500 ميكرولتر من تعليق خلية بلعم إلى الآبار غير حفز السيطرة البلاعم.
- تحفيز الضامة المتبقية مع إضافة 1: 500-1: 1000 من 0.1 ملغ / مل lipopolysaccharide في (LPS) واحتضان 5-10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل 500 ميكرولتر من الضامة حفز في الآبار مع المتوسطة غير مكيفة أو مكيفة لجنة السلامة البحرية. مزيج من الآبار التي تعصف بشكل مطرد لوحة عدة مرات.
- نقل لوحة لحاضنة لل16-18 ساعة.
- حصاد المتوسطة مكيفة البلاعم وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تحويلطاف في أنابيب جديدة وفحص لعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) و (IL-10) محتوى انترلوكين 10 من قبل مجموعات ELISA التجارية باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
6. خلية طحالية الفحص لتقييم إمكانات المناعية من الجسم الشبه الكروي-CM
- إعداد المتوسطة خلية طحالية كامل، والذي يتكون من معهد Rosewell من الحديقة التذكارية (RPMI) -1640 المتوسطة تستكمل مع المعطل للحرارة بنسبة 10٪ FBS، 1X البنسلين ستربتومايسين، و 2 المركابتويثانول. تصفية تعقيم المتوسطة.
- الطحال الحصاد من الموت الرحيم للذكور الفئران BALB / ج من خلال شق أعد على الجانب الأيسر من البطن فوق الطحال، حوالي منتصف الطريق بين الجبهة وهند الساقين 14. نقل الطحال لمصفاة الخلية 70 ميكرون لعزل splenocytes 14.
- عزل splenocytes / الخلايا الليمفاوية عن طريق دفع الطحال من خلال مصفاة 70 ميكرومتر إلى العقيمة النقيب طبق بتريز المطاط لينة / نهاية بلاستيكية من المكبس من 2-3 مل حقنة 14. استخدام حركة دائرية طحن لفصل الطحال.
- غسل مصفاة الخلية عدة مرات مع برنامج تلفزيوني الباردة ونقل الخلايا من طبق بتري إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني الباردة وأجهزة الطرد المركزي (500 x ج) في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- نضح طاف ومسح الخلايا من كريات الدم الحمراء من قبل الحضانة مع 5-10 مل من محلول أحمر خلايا الدم تحلل (في الطحال) لمدة 5-10 دقائق.
- وقف تحلل بإضافة برنامج تلفزيوني الباردة إلى الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5-10 دقيقة في 500 x ج وفي 4 درجات مئوية.
- تعليق الخلايا المعزولة في وسط خلية طحالية الكامل، تصفية من خلال مصفاة 40 ميكرون، وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. إضافة المتوسطة خلية طحالية إلى تعليق الخلية لتحقيق تركيز الخلية النهائي من 10 6 خلية / مل
ملاحظة: هذه التقنية عادة ينتج حوالي 3 × 10 7 splenocytes في الطحال الماوس. - نقل 10 6 splenocytes (حفز أو غير حفز) في الآبار من 12 لوحة جيدا وإضافة غير مكيفة (الضوابط) أو MSC-CM في الآبار في التخفيف النهائي من 1: 10-1: 20.
- حصاد CM خلية طحالية بعد 24 ساعة وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نقل طاف في أنابيب جديدة وفحص للانترفيرون غاما (IFN-γ) المحتوى من قبل عدة ELISA التجارية باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
7. سرطان البروستاتا الفحص لتقييم إمكانات المضادة للسرطان من الجسم الشبه الكروي-CM
- إعداد الكامل المتوسطة النمو RPMI التي متوسطة RPMI-1640 تستكمل مع 10FBS٪، 1X البنسلين ستربتومايسين.
- الحصول على قارورة المجمدة من خلايا سرطان البروستاتا LNCaP واحتضان القارورة لمدة 2 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- نقل محتويات القارورة في طبق ثقافة تحتوي على 30 مل من متوسط النمو RPMI كاملة باستخدام pipettor الآلية و 5 مل الماصة المصلية. يغسل عدة مرات قنينة مع المتوسط من الطبق ووضع الطبق في الحاضنة.
- قبل الخلايا تصل confluency، وغسل الثقافة مرتين مع درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني وفصل الخلايا LNCaP مع 3 مل من قبل تحسنت 0.25٪ حل التربسين / EDTA.
- تحييد التربسين في صحن مع متوسط نمو RPMI كاملة ونقل الخلايا جنبا إلى جنب مع يغسل في أنبوب مخروطي 50 مل.
- الطرد المركزي الخلايا في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف.
- إعادة تعليق الخلايا في حجم صغير من متوسط النمو RPMI الكامل والاعتماد على الخلايا السرطانية باستخدام عدادة الكريات.
- لإجراء فحص نمو الخلايا باستخدام طقم فحص تكاثر الخلايا، ونضح المتوسط من الآبار ونقل لوحة في الثلاجة (-80 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 3 ساعة.
- ذوبان الجليد لوحة وليز الخلايا في كل بئر بإضافة 100 ميكرولتر من كاشف خلية تحلل تحتوي على 180 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، و 0.2 ملغ / مل ريبونوكلياز أ.
- لمنحنى القياسية، مبالغ ليز الخلايا LNCaP كما هو موضح أعلاه.
- بعد 1 ساعة، إضافة 100 ميكرولتر من 1X العازلة خلية تحلل تحتوي على 1: 100 التخفيف من انتشار الخلايا الفحص الكاشف وقياس مضان في كل بئر لتحديد كمية الخلايا.
8. التسليم داخل الصفاق من الأجسام الشبه الكروية سليمة
- إعداد اللجان الدائمة كروي على النحو المبين أعلاه (بروتوكول 2) و resuspend رانه الكرات في محلول الملح المعقم هانك المتوازن (HBSS) تستكمل مع 0.2-0.5٪ هائل سعيد أنعم للحفاظ على ظروف XF. HSA في حل يساعد على منع التصاق المجال إلى البلاستيك خلال الحقن.
- نقل 40-120 الكروية في أنابيب مخروطية 15 مل وغسل الخلايا عن طريق إضافة 6 مل HBSS / هائل سعيد أنعم للأنابيب. السماح 3-4 دقيقة على مناطق النزول. إعداد أنبوب مخروطي مستقلة عن الكروية لكل حيوان. أيضا، إعداد أنابيب إضافية من الكروية لفحوصات تحديد الاحتفاظ كروي (انظر 8.18 أدناه)، وإنتاج العوامل العلاجية بعد نقل (انظر 8.19 أدناه) إذا رغبت في ذلك.
- نضح طاف، تراكب الكروية مع 100-200 ميكرولتر من العقيمة HBSS تستكمل مع 0.2-0.5٪ هائل سعيد أنعم، ووضع أنابيب على الجليد.
- تخدير لفترة وجيزة الحيوانات مع 2٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ حتى اختفاء منعكس قرصة أخمص القدمين لحوالي 2 دقيقة في غرفة الاستقراء.
- وضع الحيوان داخل BSL-2 لمجلس الوزراء، اسبي الظهريةCT أسفل (الجانب البطني تواجه متابعة)، مع استمرار تدفق 1.5٪ خليط الأيزوفلورين / الأكسجين عبر مخروط الأنف.
- تنظيف أسفل البطن الماوس مع مطهر مثل الكحول 70٪.
- إزالة الغطاء من 20 G عن طريق الوريد (IV) القسطرة وإجراء حقن داخل الصفاق مع الجمعية القسطرة خنجر. استخدم يدا واحدة لعقد الجلد الماوس وآخر لأداء الحقن. تحديد نقطة الحقن تقريبا في منتصف خط الاصطناعي الذي يربط منطقة الركبة استعرضوا المشتركة والتناسلية مع طرف الإبرة تشير نحو خط الوسط.
ملاحظة: التجمع القسطرة خنجر لديه مقاومة أعلى من الإبرة العادية، لذلك يهمني يجب أن يؤخذ لا لحقن إبرة عميق جدا في البطن، مما قد يؤدي إلى وقوع إصابات في الأعضاء الداخلية. يمكن أن يرى اختراق الجلد والعضلات ثم / الغشاء البريتوني خلال وضع القسطرة. - إزالة بلطف خنجر المعادن / إبرة من الجمعية القسطرة خنجر. إيكولوجياك على خنجر للدم والبول والبراز وتخلص منه. الدم على الإبرة يشير ثقب عضو داخلي (ق).
- عقد القسطرة البلاستيكية في وضع مستقيم أثناء الحقن للسماح تدفق السوائل.
- تأكيد التنسيب المناسب للقسطرة بلاستيكية عن طريق حقن ما يقرب من 100 ميكرولتر من العقيمة HBSS / هائل سعيد أنعم عن طريق القسطرة باستخدام ماصة مع طرف 100-200 ميكرولتر. وضع نهاية للطرف ماصة داخل محول القسطرة حقنة تشكيل ختم مشددة. ببطء حقن السوائل داخل التجويف البريتوني.
ملاحظة: سيتم السوائل في القسطرة وضعه بشكل صحيح تتدفق بحرية داخل التجويف البريتوني مع تعديل طفيف فقط من القسطرة. وضع غير لائق من القسطرة (تحت الجلد أو داخل الأمعاء، أو إذا كان رأس الإبرة بجروح أجهزة البريتوني مثل الكلى) ستزيد المقاومة والحد من التدفق. ووضع تحت الجلد يؤدي إلى تشكيل "فقاعة" واضحة تحت الجلد. - جمع رانه ماجستير الكروية، الذي أعد 100-200 ميكرولتر من HBSS / هائل سعيد أنعم (الخطوة 8.3)، وذلك باستخدام 200 ميكرولتر ماصة، ونقل وحدة التخزين بالكامل من المجالات (40-120 المجالات) في التجويف البريتوني عن طريق القسطرة كما هو موضح أعلاه.
- غسل الأنبوب الذي يحتوي المجالات مع 100 ميكرولتر من HBSS / هائل سعيد أنعم باستخدام نفس معلومات سرية على النحو الوارد أعلاه لجمع أي الكروية المتبقية وضخها في التجويف البريتوني.
- (اختياري) حقن في 100 ميكرولتر إضافية من HBSS / هائل سعيد أنعم في التجويف البريتوني لغسل القسطرة.
- وضع الشاش غارقة في مطهر خلال القسطرة وإزالة ببطء القسطرة من التجويف البريتوني وتخلص منه.
- تدليك بلطف التجويف البريتوني مع الأصابع لضمان التوزيع العادل للالكروية.
- السماح للحيوان استرداد تحت إشراف دقيق ومشاهدة لنزيف من موقع الحقن.
- تفقد القسطرة وأنبوب 15 مل لأي الكروية المتبقية. فمن الطبيعي أن مراعاة بعض المجالات فيقسطرة / أنبوب.
ملاحظة: هذه التقنية وصفها لجنة السلامة البحرية تسليم كروي يمكن اعتمادها للاستخدام في الحيوانات العادية أو في مجموعة متنوعة من النماذج الاصابة. وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح لحقن الكروية في الماوس إصابة القرنية ونماذج endotoxemia، وكذلك في يسببها زيموزان نموذج التهاب الصفاق 8. - لتحديد عدد الكروية المدورة (اختياري)، واستخدام المعتمدة على الحمض النووي عدد الخلايا الكمي طقم / كاشف. عقد القسطرة المستخدمة عبر أنبوب 15 مل والاستغناء بقوة HBSS / هائل سعيد أنعم عن طريق القسطرة لإجبار أي المجالات المتبقية مرة أخرى في أنبوب 15 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف. نقل الأنبوب الذي يحتوي على بيليه كروي في الثلاجة (-80 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 3 ساعة.
- ذوبان الجليد أنبوب وليز المجالات وذلك بإضافة 500 ميكرولتر من كاشف خلية تحلل تحتوي على 180 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، و 0.2 ملغ / مل ريبونوكلياز أ.
- لعنصر تحكم، الصحائفإز وليز كمية معروفة من الكروية (أي ما يعادل يفضل أن عدد الكروية على استعداد لحقنة واحدة) كما هو موضح أعلاه.
- بعد 1 ساعة، ونقل 100 ميكرولتر من المحللة الخلية، في نسختين، في صفيحة 96-جيدا، ويضاف إلى كل بئر 100 ميكرولتر من 1X العازلة خلية تحلل تحتوي على 01:50 التخفيف من انتشار الخلايا الفحص الكاشف من هذه المجموعة. بعد 10 دقيقة، وقياس مضان في كل بئر لتحديد عدد من المجالات التي لم تحقن عن طريق مقارنة العينة التجريبية (s) مع عينة السيطرة.
- تقييم مستوى تفعيل الكروية التي أعدت لحقن (اختياري) عن طريق قياس تركيز PGE2 وTSG6 التي تنتجها المجالات المنقولة. نقل 40-120 المجالات عن طريق القسطرة، كما هو موضح أعلاه، إلى 12 جيدا أو 6 جيدا لوحة تحتوي على 1 أو 2 مل αMEM تستكمل مع 2٪ FBS و1X البنسلين / الستربتومايسين. وضع لوحات في الحاضنة لمدة 6 ساعات.
- نقل متوسطة منالآبار بعد 6 ساعات إلى 1.5 أو 15 مل من أنابيب وأنابيب الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نقل طاف خالية من الخلايا إلى الطازجة 1.5 مل أنابيب باستخدام ماصة وأجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نقل أوضح سم (طاف) في الجديدة 1.5 مل الأنابيب وفحص للتركيز PGE2 (مؤشر جيد على إمكانات المضادة للالتهابات من سم) باستخدام مجموعة ELISA التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تركيز TSG6 يمكن تحديد باستخدام بروتوكول نشر 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في العمل الحالي، كانوا يعملون شنقا الثقافات قطرة لتوليد المدمجة كروية الأنسجة الصغيرة أو "الكروية" من اللجان الدائمة تفعيلها في ظل ظروف XF. خارطة الطريق الفحص في الشكل 1 يصور أن يتم تشجيع اللجان الدائمة في تقرير المصير، تجميع في الكروية عندما علقت في شنقا قطرات لمدة 72 ساعة، وبعد ذلك الكروية، أو CM محملة العوامل العلاجية المستمدة المجال، يمكن جمعها ويحتمل أن تستخدم في كل من البحوث والتطبيقات السريرية. يمكن الحصول على عدد كبير من الخلايا اللازمة لإنتاج المجال خلال أسبوع واحد من البذر واللجان الدائمة في كثافة منخفضة، عادة 100-200 خلية لكل سم 2، ومن ثم توسيع الخلايا لمدة 6-7 أيام حتى ما يقرب من 80٪ متموجة (الشكل 2 ). حركية نمو الخلايا، والتي تحددها عد خلايا قابلة للحياة اليومية، وأشارت إلى أن مرحلة التوسع قوية (يوم 07/03) في أعقاب مرحلة متخلفة وجيزة من 1-2 أيام (الشكل 2C </ قوي>). اللجان الدائمة في مرور 2 أو 3 وعادة ما تسفر 50-100٬000٬000 الخلايا من قارورة واحدة من 1 مليون خلية cryopreserved عند تربيتها في CCM.
وبعد التوسع والحصاد، وعلقت اللجان الدائمة في تركيز خلية عالية لتوليد الأجسام الشبه الكروية، وعادة ما 500-1،000 خلية لكل ميكرولتر. وعن طريق نقل 25-40 قطرات ميكرولتر من المتوسط تحتوي على اللجان الدائمة على الجانب السفلي من غطاء طبق الأنسجة الثقافة، التي انقلبت في وقت لاحق ومناسب وضعه على قاعدة الطبق (الشكل 3) إعداد شنقا الثقافات قطرة. عندما علقت في 35 قطرات ميكرولتر من CCM في 714 خلية لكل ميكرولتر (أي 25،000 خلايا من كل قطرة ماء)، اللجان الدائمة تجميع لأول مرة في المجاميع الصغيرة التي تتجمع في النهاية إلى توليد المجال مدمجة واحدة في 72 ساعة في ذروة انخفاض (الشكل 3C). تشكل الكروية أيضا أكثر من 72 ساعة في عدة أنواع من وسائل الإعلام XF المتاحة تجاريا الأمثل للتوسع MSCيشار هنا إلى أنه XFM-1 وXFM-2. ومع ذلك، وتشكيل دوائر مدمجة واحدة في XFM-1 يتطلب مكملات مع 13 ملغ / مل ألبومين المصل البشري (HSA)، وهو التركيز الذي يعكس محتوى البروتين الكلي المقدر في CCM (الشكل 3D). مجالات التعاقد واحدة لا تشكل بسهولة في الأساسي XFM-1 بدون HSA أو في خالية من البروتين αMEM (الشكل 3D). وخلال التجمع المجال، تغييرات النمط الظاهري MSC جذريا (الشكل 4)، وعندما تكون في XF المتوسطة المناسب محددة كيميائيا (أي XFM-1 + HSA)، تعبيرا عن العديد من العوامل المضادة للالتهابات هي upregulated بما في ذلك PGE2 وTSG6 (الشكل 4C). ومع ذلك، وإنتاج TSG6 وPGE2 لا زيادتها بشكل ملحوظ في اللجان الدائمة مثقف كما المجالات في XFM-2 أو XFM-1 بدون HSA (الشكل 4C). والجدير بالذكر تلك العوامل المضادة للالتهابات، وكذلك TRAIL العوامل المضادة للسرطان وIL-24، تم upregulated للغاية في اللجان الدائمة كروي قريبة ل أحادي الطبقة اللجان الدائمة، عندما رانه المجالات كانت مثقف في XFM-1 تستكمل مع إما المؤتلف HSA (rHSA) أو الصف السريرية HSA (CHSA) التي أعدت من الدم البشري (الشكل 4D).
لتقييم الإمكانات العلاجية من المجالات MSC أعد التركيبات وسائل الإعلام المختلفة، وإجراء العديد من الاختبارات العملية (الشكل 5). يتم تحديد خصائص المناعة تغييري من الكروية الأولى في المختبر عن طريق قياس تأثيرات المجال CM على مستويات السيتوكينات التي تنتجها الضامة حفز LPS وsplenocytes حفز CD3 / الخلايا الليمفاوية (الشكل 5). CM من MSC المجالات مثقف في CCM وXFM-1 / هائل سعيد أنعم إنتاج قمعت بشكل ملحوظ من البلاعم TNFα وخلية طحالية IFNγ، وفي الوقت نفسه تعزيز مستويات خلوى المضادة للالتهابات IL-10 (الشكل 5A و5B). يتم تقييم خصائص مضادة للسرطان من المجالات عن طريق قياس تأثيرات المجال CM سنمو ن ومورفولوجيا الخلايا السرطانية LNCaP البروستاتا. المتوسط XF XFM-1 / هائل سعيد أنعم خفضت بشكل فعال LNCaP انتشار مماثل لFBS التي تحتوي على CCM (الشكل 5C و5D).
الأهم من ذلك، المجالات MSC سليمة يمكن أن تدار في التجويف البريتوني من الفئران لاختبار النشاط المضادة للالتهابات من الخلايا في الجسم الحي (الشكل 6). لهذه التجارب، تعد مجالات للحقن في HBSS تحتوي على تركيز منخفض من HSA، مما يقلل التصاق لأنابيب البلاستيك مع الحفاظ على الدولة XF. وفي وقت لاحق، المجالات يمكن أن ضخت بسهولة بعد نقلها من أنبوب جمع (الشكل 6A)، وذلك باستخدام ماصة (الشكل 6B)، من خلال التجمع إبرة / قسطرة (الشكل 6C و6D) وضعه بشكل مناسب لحقن داخل الصفاق القياسية. باستخدام هذا النهج، يمكن الكروية MSC يكون بانتظامنقل في كفاءة أكبر من 90٪ (الشكل 6E و6F) دون تعطيل سلامتها (الشكل 6G و6H). المواقع غير لائق من طرف القسطرة داخل التجويف البريتوني يؤدي إلى ضعف تسليم الكرة والاحتفاظ بها عالية (الشكل 6F). الأهم من ذلك، مستوى الاحتفاظ المجال داخل ماصة / القسطرة يمكن تحديد نوعيا عن طريق التفتيش البصري، أو كميا عن طريق جمع / الناشر المجالات المدورة وقياس عدد الخلايا مع المتاحة تجاريا المعتمدة على الحمض النووي الخلوي الكمي كاشف / مجموعة (الشكل 6F). بعد الحقن تحليل الاحتفاظ المجال يساعد على خلق معايير الاشتمال / الاستبعاد خلال التجريب. والجدير بالذكر أن تتم المحافظة على القدرة على CCM وXFM-1 / هائل سعيد أنعم الكروية لإفراز مستويات عالية من TSG6 وPGE2 لا يقل عن 6 ساعة بعد نقل المجالات من شنقا الثقافات انخفاض (الشكل 6I). على غرار في المختبر EFتأثيرات سلبية، الكرات XFM-1 / هائل سعيد أنعم حقن في التجويف البريتوني من الفئران، مباشرة بعد تحريض من الالتهابات التي كتبها الادارة الرابع من LPS، وتعزيز PGE2 وIL-10 المستويات في الغشاء البريتوني، بينما تتناقص الموالية للالتهابات TNFα (الشكل 6J).
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للمنصة وضعت لتسخير secretome من اللجان الدائمة تستعد كما كروية الأنسجة الدقيقة في ظل ظروف XF. وبعد التوسع كما الثقافات أحادي الطبقة (1)، وعلقت اللجان الدائمة في شنقا قطرات من غطاء صحن الثقافة (2) في تركيز خلية عالية لتفعيل / رئيس الوزراء الخلايا. بعد 72 ساعة، فإن كلا من (3) المتوسط مكيفة (CM) و (4) يمكن حصاده الكروية سليمة من قطرات واستخدامها في مختلف التطبيقات المصب. وCM غنية في العوامل تنظيم الجهاز المناعي، فضلا عن غيرها من compon العلاجيةالوالدان. الأجسام الشبه الكروية المدمجة التي تشكل في شنقا قطرات يمكن نقلها بسهولة باستخدام ماصة (5) وفعالية تدار في الجسم الحي من خلال القسطرة (6). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خصائص النمو من اللجان الدائمة المشتقة من نخاع العظام في الثقافات أحادي الطبقة. وكانت المصنفة اللجان الدائمة في مرور 2 في كثافة منخفضة (100 خلية لكل سم 2) في 15 سم أطباق (15000 خلية لكل طبق) وتربيتها لمدة 7 أيام في CCM. تم تغيير المتوسطة في يوم 3 ثم مرة أخرى في يوم 5 أو 6 (24-48 ساعة قبل الحصاد). تمثيلية الميكروسكوب المرحلة على النقيض من اللجان الدائمة 3 أيام (A) و 7 أيام (ب) بعد طلاء الخلايا. شريط مقياس = 200 ميكرون. (C) حركية النمو من اللجان الدائمةتم الحصول عليها من 3 المانحين كانوا مصممين عن طريق حساب عدد الخلايا الملتصقة قابلة للحياة اليومية من يوم 2 الى يوم 7. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): إعداد شنقا الثقافات انخفاض لفتيلة الكروية MSC في XF المتوسطة. (A) صورة مسيئة للتقنية إلى طبقة بسرعة شنقا قطرات على الجانب السفلي من غطاء الأنسجة صحن الثقافة. (ب) صورة توضح شنقا قطرات بعد انقلاب وتحديد المواقع من الغطاء على قاعدة الطبق. (ج) التغيرات التي تعتمد على الوقت في تجميع 25،000 اللجان الدائمة في قطرة شنقا كما تصور بواسطة المجهر على النقيض من المرحلة. وتركز الهدف على قمة الهبوط. شريط مقياس = 500 ميكرون. (D) إيماغيس من المجالات MSC شكلت بعد 3 أيام في شنقا انخفاض الثقافات باستخدام تركيبات وسائل الإعلام المختلفة بما في ذلك αMEM مع وبدون FBS (أي الحزب الحاكم)، XFM-1 مع وبدون هائل سعيد أنعم، وXFM-2 مع وبدون هائل سعيد أنعم. شريط مقياس = 200 ميكرون. وقد تم الحصول على البيانات في لوحة (د) من المادة الأصلية بإذن من الناشر (14). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تقييم تفعيل لجنة السلامة البحرية في 3-D الثقافات XF. ويتم حصاد (A) كرات / CM بعد 72 ساعة من قلب / إمالة غطاء طبق وإجبار قطرات إلى حافة باستخدام رافع الخلية. مجالات تجميعها من 25،000 الخلايا يمكن تصور بسهولة أثناء جمع. (ب) صورة من يقاربالمطاف 500 المجالات التي تم جمعها من الأغطية العديد من لوحات زراعة الأنسجة. مجالات تنحدر بسرعة إلى أسفل الأنبوب دون الطرد المركزي. (ج) مستوى PGE2 يفرز من المجالات MSC بعد قياس 72 ساعة بواسطة ELISA. وقد استخدم في الوقت الحقيقي RT-PCR لقياس مستويات TSG6. كلا TSG6 وPGE2 هي علامات قيمة لفحص تفعيل لجنة السلامة البحرية في الكروية. أظهر المتوسطة XF XFM-1 + HSA مستوى عال من PGE2 والإنتاج TSG6 (مربعات حمراء). وتظهر البيانات كما يعني ± SD وحللت التي كتبها t-الطالب اختبار (*** P <0.001، مقارنة مع عينة αMEM). (D) PGE2 ELISA وفي الوقت الحقيقي RT-PCR المقايسات على المجالات التي تنتج في CCM وXFM-1 تستكمل على وجه التحديد مع 13 ملغ / مل HSA المؤتلف (rHSA)، أو درجة السريري HSA (CHSA) التي أعدت من الدم الوريدي البشري. تم تحديد أضعاف التغييرات من اللجان الدائمة أحادي الطبقة ملتصقة (RQ = 1). وتظهر البيانات كما يعني ± SD وحللت التي كتبها t-الطالب اختبار (** ف <0.01 ***، ف <0.001 مقارنة بأحادي الطبقة اللجان الدائمة). وقد تم الحصول على بعض البيانات في لوحات جيم ودال من المادة الأصلية بإذن من الناشر (14). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: في المقايسات الفنية المختبر لتقييم خصائص مضادة للالتهابات ومضادة للسرطان MSC-CM تم جمعها من شنقا الثقافات قطرة. (أ) ممثل النتائج من ELISAs تظهر آثار المجال CM (CCM وXFM-1 / هائل سعيد أنعم) على إنتاج TNFα و IL-10 من قبل الضامة الماوس حفز LPS (MQ). (ب) ممثل النتائج من إليسا تظهر آثار المجال CM (CCM وXFM-1 / هائل سعيد أنعم) على إنتاج IFNγ بواسطة splenocytes الماوس (SPL) حفز مع الأجسام المضادة لمكافحة CD3. الميكروسكوب (C) المرحلة النقيض من الخلايا السرطانية LNCaP البروستاتا تعامل مع CCM الأساسي وXFM-1 / هائل سعيد أنعم أو المتوسطة مكيفة (CM) من المجالات MSC أعدت في CCM وXFM-1 / هائل سعيد أنعم. كانت خلايا LNCaP مثقف في RPMI المتوسطة (مراقبة). شريط المقياس هو 200 ميكرون. تم تحديد (D) التغيرات الكمية في نمو الخلايا السرطانية LNCaP البروستاتا مع المتاحة تجاريا خلية الكمي كاشف / مجموعة المعتمدة على الحمض النووي. خط منقط يشير كثافة البذر من 5000 خلية لكل جيدا. وتظهر البيانات في كل اللوحات كما يعني ± SD، وحللت التي كتبها t-الطالب اختبار (*** P <0.001). وقد تم الحصول على بعض البيانات في جميع لوحات من المواد الأصلية بإذن من الناشر (14). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تحميل / 55126 / 55126fig6.jpg "/>
الشكل 6: نقل الفعال للالكروية اللجان الدائمة سليمة، الذي أعد في ظل ظروف XF، وذلك باستخدام نظام 20G الرابع إبرة / القسطرة. (أ) صورة الممثل من 15 مل أنبوب مخروطي مع XFM-1 / مجالات HSA MSC أعدت للحقن في HBSS تحتوي على 0.2٪ هائل سعيد أنعم. (ب) صورة الممثل من المجالات MSC بعد التطلع إلى 200 ميكرولتر ماصة. (ج) صورة من التجمع 20 إبرة G / القسطرة المستخدمة لإدارة الكروية MSC سليمة في الفئران. (D) صورة مما يدل تحديد المواقع المناسبة من طرف ماصة في محول للقسطرة البولي يوريثان. (E) صورة من المجالات MSC مباشرة بعد تمريرها عن طريق القسطرة في صحن الثقافة. تقريبا تم نقل 95 مجالات من أصل 100. تم تحديد (F) كفاءة تسليم الكرة إلى التجويف البريتوني من الفئران عن طريق جمع / الناشر المجالات الاحتفاظ بها فيماصة / القسطرة وأرقام الهواتف المحمولة قياس، عبر المعتمدة على الحمض النووي الخلوي الكمي فحص التجاري، نسبة إلى عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من مجموعة كاملة من المجالات هي lysed. ويشير الخط الأحمر المنقط كفاءة نقل 90٪. وقد لوحظ تسليم المجال الفقراء (71٪) مع حقنة واحدة (السهم). (G) الميكروسكوب المرحلة على النقيض من المجالات في لوحة E (تضخيم رأي). شريط مقياس = 200 ميكرون. (H) صورة مجهرية المرحلة على النقيض من XFM-1 / هائل سعيد أنعم المجال 16 ساعة بعد نقل على طبق زراعة الأنسجة. المحافظة على الأرومة الليفية، التشكل على شكل مغزل من اللجان الدائمة في الخلايا التي هاجرت من المجال. شريط مقياس = 200 ميكرون. المقايسات (I) ELISA لعوامل مضادة للالتهاب أجريت TSG6 وPGE2 على CM جمعت 6 ساعات بعد نقل المجالات في 6 لوحات جيدا تحتوي على 2 مل αMEM / 2٪ FBS. المجالات التي أعدت في المتوسط XF XFM-1 / أظهر HSA أعلى مستوى من TSG6 وإفراز PGE2 (مربعات حمراء). البيانات، كما أعرب عن متوسطSD ±، تم تحليلها من قبل ر الطالب اختبار (*** P <0.001، مقارنة مع عينة αMEM). تم الحصول على بعض البيانات من المقال الأصلي بإذن من الناشر (14). (J) الرسوم البيانية التمثيلية التي توضح قدرة الكروية، يحقن في التجويف البريتوني، لزيادة PGE2 البريتوني وIL-10، بينما تتناقص مستوى TNFα في الفئران تحدى عن طريق الحقن في الوريد من الذيفان الداخلي (LPS). تم الحصول على عينات من البريتوني غسيل 6 ساعات بعد تحريض الالتهاب وتسليم 80 الكروية. البيانات، كما أعرب عن متوسط ± SD، تم تحليلها من قبل ر الطالب اختبار (* ف <0.05، ** ف <0.01، مقارنة مع الشاهد). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لجنة السلامة البحرية المثلى لاستخدامها في بعض التطبيقات البحثية والسريرية يجب تفعيلها للغاية لتحقيق أقصى قدر من مصلحتهم، وعلى استعداد تفضيلي في ظل ظروف XF محددة كيميائيا للحد من وصول المستضدات المحتملة من مكونات المتوسطة xenogeneic مثل FBS. في البروتوكولات المذكورة هنا، لقد أظهرنا طرق ل1) تفعيل اللجان الدائمة في الثقافة 3D عن طريق تشكيل الأجسام الشبه الكروية، 2) تحقيق تفعيل 3D من اللجان الدائمة في ظل ظروف XF، 3) تقييم مستويات تفعيل اللجان الدائمة كروي في ما يخص مكافحة بهم التهابات، والمناعية تغييري، وإمكانيات مضادة للسرطان، و4) تقديم اللجان الدائمة تفعيلها كما الكروية سليمة في الفئران.
اللجان الدائمة هي الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يمكن أن تكون معزولة عن طريق الالتزام البلاستيك من العديد من أنسجة البالغين بما في ذلك نخاع العظام والأنسجة الدهنية. يتم نشر اللجان الدائمة بسهولة على البلاستيك زراعة الأنسجة تحت مرتفعة نسبيا (10-20٪) تركيزات FBS، والتعبير عن مجموعة متميزة من علامات سطح، ويمكن أن تكون متباينة على الأقل إلى مكون الشحم، عظمية، والأنساب المولدة للغضروف 1، 16، 17، 18. وقد أثبتت اللجان الدائمة لممارسة آثار مفيدة في مختلف النماذج الحيوانية من الأمراض التي تصيب الإنسان، على الرغم من أنها تظهر أن تستمر عابر فقط بعد إدارتها في الجسم الحي. ولذلك كان يطلق عليه تأثير اللجان الدائمة "الكر والفر"، وغالبا ما بوساطة عوامل نظير الصماوي المضادة للالتهابات والمناعية، مثل PGE2، TSG-6، وindoleamine 2،3-دي أكسيجيناز (إيدو)، يفرز من قبل اللجان الدائمة 2 ، 3، 11، 19، 20، 21. ومع ذلك، من أجل إنتاج هذه العوامل، اللجان الدائمة يتطلب التنشيط، إما عن طريق إشارات من الأنسجة التالفة أو من ج المناعةملتعلمي اللغة اإلنكليزية للمتلقي. وفي وقت لاحق، وكان هناك اهتمام الناشئة لتطوير MSC تفعيل مسبق أو فتيلة بروتوكولات قبل التسليم من الخلايا في الحيوانات أو المرضى 22. أيضا، فإن وجود عناصر FBS المستضدات في الأعمال التحضيرية لجنة السلامة البحرية القياسية أثار مخاوف. لذلك، وقد أجريت دراسات لتحديد الظروف XF محددة كيميائيا المثلى للثقافات MSC. في عملنا الأخير، ونحن أول من أظهر أن اللجان الدائمة يمكن تفعيلها في 3D من تشكيل الأجسام الشبه الكروية، ثم اكتشفت أن تنشيط الخلايا لا يمكن أن يتحقق أيضا في ظل ظروف محددة XF 8 و 12 و 13 و 14.
وقد استخدمت تقنيات زراعة الخلايا 3D لعقود مع الهدف المتمثل في توفير الظروف الفسيولوجية حقيقية في البحث القائم على الخلية. الثقافات في 2D تتجاهل طبيعة 3D من الأنسجة، وبالتالي لا ألخص دائماالخلية الخلية الى والتفاعلات الخلية إلى مصفوفة الهامة في إشارة الخلية. العديد من التقنيات ثقافة 3D تستخدم سفن الدورية والقوارير الدوار، أو مختلف الأسطح غير ملتصقة، ومع ذلك، فإن العائق الاكبر في كثير من هذه الأساليب هو عدم تجانس حجم كروي ولدت و / أو شرط من معدات باهظة الثمن محددة. كما تم تنفيذ الابحاث التي تستخدم الثقافات قطرة شنقا التي تشجع أساسا اللجان الدائمة للعفويا مجموع المباراتين إلى كروي واحد 4، 5، 6، 7، 8، 9، 23. والجدير بالذكر، شنقا الثقافات قطرة دعم الجمعية من الأنسجة الصغيرة موحدة نسبيا / المجاميع، مع فائدة إضافية تتمثل في أن تكون قادرة على التعامل بسهولة حجم مجموع الخلايا عن طريق ضبط تركيز الخلية و / أو حجم الانخفاض. وعلاوة على ذلك، والتمكن من شنقا دشرطة عمان السلطانية تقنية ثقافة لا يتطلب تدريبا مكثفا. قطرات من 25-40 ميكرولتر يمكن إعدادها بسهولة مع اللجان الدائمة في تركيزات عالية الخلية، وعادة ما 500-1،000 خلية لكل ميكرولتر. قطرات أصغر من 20 ميكرولتر تميل إلى تتبخر بسرعة، وتلك ميكرولتر أكبر من 45 في كثير من الأحيان تشويه عبر غطاء خلال انقلاب. ومع ذلك، عندما التقليب غطاء يحتوي على قطرات من أي حجم، وسرعة وتوجه معلمات الحرجة للنظر في الحفاظ على التوتر السطحي، والشكل المناسب من قطرة / كروي. الثقافة وانقطاع تدفق الهواء الصحيح في حاضنة مهمة لضمان تجميع اللجان الدائمة في مجال واحد في كل قطرة أيضا.
عيوب هذه التقنية هو أن لوحات تحتوي على قطرات شنقا لا ينبغي أن تكون مكدسة في الحاضنة أو نقلها خلال تجميع المجال، مما يجعل نطاق والمتابعة للعلاج المريض صعبة. وعلاوة على ذلك، وتغيير المتوسطة في شنقا الثقافات انخفاض غير صعبة للغاية، وبالتالي يجب أن يكون الثقافات على المدى الطويل للمركباتoided. وبالإضافة إلى ذلك، وانخفاض نسبة وسائل الاعلام الى خلية في شنقا قطرات يمكن أن يسبب نضوب المغذيات وتراكم النفايات مما يؤدي في النهاية إلى فقدان الوظائف الخلوية الهامة و / أو موت الخلية.
ومع ذلك، مع تقنية انخفاض شنقا المناسبة، لقد أثبتنا أن اللجان الدائمة في الكروية تصبح نشطة للغاية أو معبي، في أن تصبح الخلايا مصانع قوية الجزيئات المضادة للالتهابات PGE2 وTSG6، وكذلك جزيئات مضادة للسرطان IL-24 و ممر المشاة. لقد أثبتنا أن الكروية MSC هي في الواقع المضادة للالتهابات والمناعية، ولها خصائص مضادة للسرطان متفوقة على نظيراتها أحادي الطبقة 2D في العديد من المقايسات الفنية باستخدام الضامة مثقف، splenocytes، وخلايا سرطان البروستاتا 8 و 12 و 13 و 14. وعلاوة على ذلك، لقد أظهرنا أن الكروية MSC يمكن أن يؤدي الى تأثيرات قوية مضادة للالتهابات عندما تدارفي التجويف البريتوني من الفئران مع التهاب الصفاق 8. على وجه التحديد، وأظهرت لنا أن الكروية الكبيرة ما يقرب من 400-500 ميكرون في القطر (25،000-30،000 اللجان الدائمة لكل منهما) يمكن تقديمها بكفاءة في حجم صغير من HBSS باستخدام إبرة 20G / الجمعية القسطرة وماصة القياسية. مع هذا الأسلوب، غير لائق القسطرة التنسيب، مما يؤدي إلى مقاومة عالية للتدفق السوائل، يمكن تحديدها بسهولة قبل كروي نقل عن طريق حقن أولا كمية صغيرة من HBSS / هائل سعيد أنعم كما هو موضح في البروتوكولات. سوف الكروية في القسطرة وضعه بشكل صحيح تتدفق بحرية، شريطة أن يكون HBSS وتستكمل مع HSA لتقليل التصاق المجال لأنابيب البلاستيك، ويمكن تصور بسهولة. وعلاوة على ذلك، فإن هذا الأسلوب يمنع إجهاد القص على الخلايا التي يمكن أن تحدث باستخدام إبرة القياسية / حقنة للحقن، والابتعاد عن الحاجة إلى شق جراحي الذي ينطوي على مخاطر أعلى للإصابة وأكثر تحديا من الناحية التقنية. عيب واحد رئيسي هو رلا يمكن إلا أن الأرقام قبعة كبيرة من الأجسام الشبه الكروية يتم حقنه في تجاويف الجسم واسعة، مثل التجويف البريتوني، والمقاومة ضد نقل المجال من خلال القسطرة عالية في المناطق الضيقة.
نحن أيضا في الآونة الأخيرة أظهرت أن المستوى نفسه من تفعيل لجنة السلامة البحرية في الكروية يمكن أن يتحقق عن طريق استخدام وسيلة XF محددة متاحة تجاريا، المشار إليها هنا كما XFM-1، طالما استكمل مع HSA تم الحصول عليها من الدم البشري أو إعدادها من خلال تقنيات المؤتلف 14. ومن المهم أن نلاحظ هنا أن الكروية MSC لا تنتج مستويات عالية من PGE2 وTSG6 في جميع أنواع وسائل الإعلام XF 14، ربما لأن معظم وسائل الإعلام XF عن اللجان الدائمة صيغت في البداية للتوسع الأمثل للخلايا في 2D. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن أنواع مختلفة من HSA تختلف في قوتها 14. وبالإضافة إلى ذلك، الكشف عن المستوى المطلق للPGE2 في سم من الأجسام الشبه الكروية يمكنهم تختلف طفيفلاي مثل ELISA المستخدمة لPGE2 هو في الواقع فحص المنافسة. وبالتالي، من المهم أن تشمل الضوابط المناسبة في كل PGE2 ELISA وتجنب مباشرة مقارنة البيانات بين عينات يعاير في أوقات مختلفة أو في لوحات مختلفة. وعلاوة على ذلك، اللجان الدائمة يجب غسلها جيدا في XF المتوسطة قبل إعداد شنقا قطرات من أجل إزالة CCM المتبقية، وبالتالي الحد المرحل من مكونات FBS. البروتوكولات وصفها هنا يمكن اعتمادها بسهولة لتقييم التركيبات وسائل الإعلام الأخرى على تشكيل المجال والتعبير الجيني العلاجي.
ومن الواضح أن يتم تعيين العديد من الأحداث إشارة الخلية التي لا تحدث عادة في 2D اللجان الدائمة في الحركة عندما اللجان الدائمة يتم تربيتها في 3D. خلية الى خلية والتفاعلات الخلية إلى مصفوفة، بوساطة cadherins وintegrins دليل تشكيل كروي والضغط 24 و 25 و 26 و من المرجح الحرجة للعلاج كروي. كما الخلايا مجموع المباراتين وشاركMPACT إلى الكروية، ومختلف إشارات التوتر، بما في ذلك الخلايا الصغيرة، والمساعدة في عملية تفعيل لجنة السلامة البحرية التي تؤدي إلى إنتاج العديد من العوامل المحتملة العلاجية 4، 5. أظهرنا سابقا الدور الحاسم للautocrine IL-1 الإشارات في تفعيل لجنة السلامة البحرية وإنتاج PGE2 وTSG6 12. في حين لا يزال هناك الكثير غير معروف حول مختلف مسارات الإشارات التي تساعد في تفعيل لجنة السلامة البحرية، شنقا منصة ثقافة الإفلات تتيح وسيلة عملية لدراسة هذه الظاهرة وتحسين العلاجات القائمة على لجنة السلامة البحرية. وعموما، التي وصفناها، في البروتوكولات هنا، وسبل تفعيل أو فتيلة اللجان الدائمة في الثقافات 3D، في ظل ظروف XF محددة كيميائيا، لإنتاج المضادة للالتهابات، المناعية، والعوامل المضادة للسرطان. وصفناها أيضا كيف يمكن أن يتم تسليم هذه الأجسام الشبه الكروية MSC سليمة في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
| FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
| L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
| Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
| Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
| Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
| water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
| Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
| Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
| PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
| 0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
| 15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
| 50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
| Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
| Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
| rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
| Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
| Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
| Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
| High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
| Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
| Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
| (-80 °C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
| PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
| J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
| 12-well plate | Corning | 3513 | in vitro macrophage stimulation |
| LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
| Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | in vitro splenocyte stimulation |
| 70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
| Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
| Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
| LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
| DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
| Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.) |
| HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
| Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
| Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
| Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
| Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
References
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560 (2013).
- Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
- Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357 (2016).
- Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
- Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
- Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
- Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White. , http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html (2016).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
- Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
- Krampera, M. Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
- Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution? Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
- Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).
