Abstract
间充质干/基质细胞(MSCs)持有生物工程和再生医学很大的希望。的MSC可以从多个成人组织通过其强粘附到组织培养塑料中分离,然后在体外进一步扩大,最常使用的胎牛血清(FBS)。因为FBS可引起干细胞成为免疫原性的,其中的MSC培养物的存在限制了细胞的临床和实验的应用程序。因此,研究用人化学定义无异物(XF)媒体MSC文化是非常有价值的。 MSC的许多有益效果已被归因于它们对调节炎症和免疫能力,主要通过免疫调节因子的分泌,如肿瘤坏死因子刺激的基因6(TSG6)和前列腺素E2(PGE 2)。然而,干细胞需要活化以产生这些因素,并且自MSC的效果往往短暂的,极大的兴趣已经出现以发现的激活预细胞PRIO方式R以它们的使用,从而消除了滞后时间用于体内活化。这里,我们提出的协议能够有效地激活或首要的MSC在三维(3D)培养物 化学上确定的XF的条件下,并施用在体内这些预活化的MSC。具体地讲,我们首先描述的方法生成使用XF介质球形MSC微组织或在悬滴“球体”和演示如何球体和条件培养基(CM)可收获用于各种应用。第二,我们描述的基因表达的屏幕和在体外功能测定迅速评估MSC活化在球状体的水平,强调细胞的抗炎和抗肿瘤潜力。第三,我们描述了一种新的方法来注入完好的MSC球体成用于体内效力测试小鼠腹腔。总体来说,此方案得到克服根据化学定义XF CON预激活干细胞的主要挑战条件和提供了一个灵活的系统管理MSC球体的疗法。
Introduction
间充质干细胞/基质细胞(MSCs)已经显示关于各种再生医学的方法的巨大潜力。的MSC最初分离的骨髓的基质组分,但至今已从许多其它成体组织,包括脂肪组织1,2,3获得。有趣的是,主要分离方法涵盖MSCs的显着属性,以紧密附着到组织培养塑料中的胎牛血清(FBS)的存在。虽然这种传统的隔离技术允许在二维(2D)培养容易和迅速扩展的MSC,它也很人工和无视导致重要的细胞特征4潜在损失的天然三维(3D)环境的意义,5 6。因此,干细胞在三维文化的研究,比传统的二维培养更符合生理,已经出现在搜索“丢失/减弱”MSC特性。此外,极大的兴趣已经上升到识别(XF)无异物化学定义的条件MSC文化和活化,从而使细胞临床应用更适合。
许多研究已经发表表明无论在生物材料和球形聚集体或球状体MSC的3D培养。在生物材料的MSC最初设计用于组织工程的方法与细胞种子支架替换损坏的组织,而MSC的球体培养物被视为一种方式来理解用于在临床前或临床试验中的治疗的细胞给药后在体内的MSC行为4,5,7。有趣的是,干细胞形式球状体自发时不允许粘附到组织培养塑料8,9,10。传统上,细胞聚集是由旋转烧瓶方法或液体覆盖技术,最初用于癌症生物学中的努力,试图模仿肿瘤微环境的方法促进。最近,其他方法已经浮现演示在培养皿的细胞聚集预涂具有特定的化学物质,以防止细胞-塑料粘附4,5,6。之一,以产生MSC球状体的最简单和最经济的方法是将培养他们在悬滴,这是经常用于产生从胚胎干细胞的胚状体的技术。与悬滴培养技术,细胞粘附于组织培养塑料是通过在介质的上的组织培养皿盖的下侧下降的细胞悬浮并允许重力促进细胞aggreg防止通货膨胀在下拉的顶点。球体大小可以通过改变细胞浓度或者滴体积,使得悬滴培养尤其容易控制可以容易地操纵。
关于MSC的3D培养早期的研究表明在细胞中的3D相比,他们的2D对应6,8,9的特性基团的差异。同时,报告表明,干细胞在体内的有益效果依靠其成为通过微环境线索激活,并且作为响应,以产生抗炎和免疫调节因子11的能力。有趣的是,许多这些因素,如前列腺素E2(PGE 2),肿瘤坏死因子刺激的基因6(TSG6)和肝细胞生长因子(HGF)是在更大的数量由MSC球体比传统的二维的MSCs铺平了道路产生的理念使用3D培养激活细胞8,12,13。此外,基因活化在3D培养出现注射入小鼠12后概括机制,至少部分,细胞活化。通过激活之前将其在实验中使用的MSC,该细胞的作用可以被延长,更突出在体内传统的MSC效果往往延迟和短暂的,并且可以被描述为“打并运行”。在过去的几年中,使用MSC球状体重要的功能性研究已经表明,它们可以抑制炎症反应和通过影响效应细胞如巨噬细胞,树突细胞,嗜中性粒细胞和T细胞使得球状体致敏的MSC 2的一个有吸引力的形式调节体内免疫,3。此外,生产抗癌分子,如int的erleukin-24(IL-24),肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL),在干细胞的相对的三维培养物提高到单层的MSC,这可能对靶向癌症疗法8,10,14被利用的现象。
由于传统的MSC文化不仅需要利用组织培养塑料也FBS,另一个障碍,使MSC球体更适合临床使用已被克服。为了解决这一难题,我们最近发现形成的MSC球状体的特定化学成分确定的XF的条件下,建立所得到的MSC球体被激活以产生相同的抗炎和抗肿瘤分子作为在条件与FBS 14产生的球状体。这里,这些研究结果在演示中使用XF 3D培养预活化的MSCs的产生几个详细方案提出媒体。此外,协议呈现描述评估MSC的活化水平的问候其抗炎,免疫调节和抗肿瘤作用,与递送完整球体到小鼠的实用方法一起有效的方法。
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Protocol
1. MSC分离和扩增
- 获得早期中心代MSCs编制和成体干细胞(分布http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html )15作为冷冻瓶。另外,隔离骨髓穿刺以下例行协议14 MSC和存储为冷冻小瓶。
- 制备完全培养基(CCM),它是最小必需培养基α(αMEM)补充有15-20%的溢价选择FBS,2mM L-谷氨酰胺和1x青霉素 - 链霉素。消毒通过过滤介质。
- 放置30毫升CCM成150mm的细胞培养皿,在含有5%CO 2的潮湿培养箱中孵育盘30分钟,在37℃。
- 孵育含有2分钟约10 6个干细胞在37℃水浴中的冷冻小瓶中。
- 使用5毫升血清吸管转移小瓶的内容到培养皿,然后从培养皿1-2毫升的CCM洗小瓶几次以捕获剩余的细胞。放置隔夜菜在适当的孵化器。
- 小心地用室温磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤培养物两次,并用3毫升预热0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)溶液分离的MSC。支队通常需要在孵化器,大约3-4分钟。
- 中和胰蛋白酶在用6毫升的CCM预热至37℃的菜,将细胞悬液转移到50毫升锥形管中。用PBS洗涤的结合起来,最大限度地提高细胞产量。
- 离心10分钟将细胞(450 XG)在室温和吸出上清液。
- 重悬在CCM中的一个小体积的细胞,并计数使用血细胞计数器和台盼蓝的活细胞。
- 种子150毫米的菜肴适当数量为100个/厘米2
- 收获细胞如上述用胰蛋白酶/ EDTA和所有的细胞结合成一个单一的锥形管与适当的介质。离心再次并重新悬浮细胞成用于细胞计数的相同培养基的小体积。使用标准的CCM(含有FBS)或各种市售XF培养基配方,这里称为XF介质-1(XFM-1)和XF培养基-2(XFM-2),两者都具有和不具有人血清白蛋白(HSA,13毫克/毫升)的补充。
在3-D激活MSC球体2.准备下XF条件悬滴文化
- 以产生约25,000个细胞的球形体,淡化收获的MSC到CCM,XFM-1,XFM-1 + HSA(13毫克/毫升),XFM-2,或XFM-2 + HSA(13毫克/毫升)在714细胞/微升。
- 细胞吸取35微升/滴于150mm的倒置培养皿盖的下侧。多个液滴可通过使用多道移液器容易地吸取。
注意:如果大或小球体的需要,改变细胞浓度或滴体积(25-45微升)适当。 - 转移20毫升室温的PBS入菜的基极和在一个连续和稳定运动翻转盖,含有该液滴,使液滴顶点朝下。小心地将盖培养皿的底部上。
- 转移盘进入孵化器3天,而不会干扰它允许适当的球形组装。
- 72小时后,通过仔细地除去在盖和反相它使得滴,再次,朝上开始球体收获。
- 角盖到大约10-20°及推液滴,含有该球状体,以使用细胞升降板边缘。
- 传送球体和介质入15ml锥形管与1000微升管TTE。使用室温下PBS中并用相同的尖端洗涤板并保证球体的最大恢复的吸移管。
- 对于实时PCR测定(协议3),离心球悬浮液在450×g离心在室温下5分钟,吸出上清液。用PBS洗涤球体和重复离心和愿望步骤中都。用于输送到动物(协议8),使球在管(3-4〜分钟)的底部不离心沉淀。
抗炎和抗癌标记3.实时PCR
- 使用具有均化列和无RNA的DNA酶设置RNA提取试剂盒来分离从单层的MSC不含DNA的总RNA(协议1)和用PBS洗涤并离心该MSC球状体(协议2)。
- 裂解至少100,000单层MSC和从每个条件在单独15毫升20球状体锥形管与含有β巯基乙醇(1:100)RLT缓冲液中。
- 横贯FER的充分混合裂解物进1.5毫升无RNase管并放入一个冷冻器(-80℃)下至少3小时在球体裂解以帮助。
- 在冰上解冻,涡旋的细胞裂解物短暂,并按照制造商的说明用市售的哺乳动物总RNA分离试剂盒提取RNA。
- 量化和评估使用分光光度计分离的RNA的质量。
- 使用高容量cDNA的反转录试剂盒或根据等同于制造商的说明来产生的cDNA的实时PCR。
- 放置cDNA样品,市售设计实时PCR引物/探针(基因表达分析),和PCR主混合物在冰上。使用的引物/探针GAPDH(对照),PTGS2(COX-2,抗发炎),TNFAIP6(TSG6,消炎),TRAIL(抗癌),和IL-24(抗肿瘤)。
- 根据制造商的基因表达测定法和快速李海说明准备实时PCR反应RSAL预混。
- 遵循了实时PCR仪的准则用于产生实验文件和执行运行。
- 通过计算使用GAPDH作为内对照和单层干细胞作为基准8,14基因表达的相对变化(相对量,RQ)分析使用ΔΔCT法的数据。
4.收集CM为免疫调节的测定和抗癌潜力
- 收获球体和CM然而,如上所述成一个15毫升的锥形管,用细胞升降机和吸管,不与PBS洗涤培养皿的盖子,因为这会稀释CM。
- 离心在450 xg离心在室温下5分钟,小心收集用移液器将无细胞上清液,并且将上清液转移到1.5毫升管中。
- 离心10,000 XG在室温下5-10分钟,小心收集CLarified CM用吸管,并传送CM进入新的1.5毫升管储存在冷冻(-80℃)。使用它的多种测定时冷冻之前以制备CM的等分试样。
注意:在此之前执行的下游测定,PGE 2浓度,CM的抗炎潜力的良好指标,可以使用根据制造商的说明商业ELISA试剂盒确定。可以使用发布的协议14来决定TSG6浓度。
5.巨噬细胞测定来评估MSC-CM的抗炎潜力
- 制备巨噬细胞中,它由含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和补充有10%的溢价选择FBS和1x青霉素 - 链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)的。过滤消毒网上平台。
- 获得的约10 6的J774巨噬细胞冷冻小瓶中,并孵育小瓶在37℃水浴中2分钟。
- 吸出上清液,暂停的巨噬细胞在1ml巨噬细胞培养基中,巨噬细胞转移到装有30ml巨噬细胞培养基的150mm的陪替氏培养皿。
- 改变介质每2天孵化在孵化器中的细胞,直到大约70-80%汇合。
注:巨噬细胞不紧紧粘附在陪替氏培养皿,因此应小心不要失去细胞与培养基的变化。 - 由巨噬细胞介质喷涂到用吸管将细胞收获巨噬细胞。转移细胞到50ml锥形管中并离心5分钟,在200-300 XG和室温。
- 吸出上清液并悬浮细胞在小体积的巨噬细胞中的用于与血球细胞计数。调至浓度为与巨噬箱200,000个细胞/ ml的dium。
- 以启动设置为巨噬细胞的测定法中,添加480微升的巨噬细胞中的成12孔板的孔中。
- 加入20μl的巨噬细胞中的成非刺激对照的孔和20μl的非空调或MSC条件培养基中,上面制备,在实验孔。通过轻敲板混合孔中的介质。
- 转移500μl的巨噬细胞悬浮液的非刺激的巨噬细胞的对照孔。
- 刺激并加入1剩余的巨噬细胞:500-1:0.1的1000毫克/毫升脂多糖(LPS)和室温下培养5-10分钟。
- 转移500微升的刺激巨噬细胞的入井与非空调或MSC条件培养基。通过几次稳步摇动板混合的孔中。
- 板块转移到孵化器为16-18小时。
- 收获在500 XG的巨噬细胞条件培养基,离心,在室温下5分钟。
- 转让上清液到新的管中,测定用于肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10)的含量按照制造商的说明书的商业ELISA试剂盒。
6.脾细胞检测,以评估球体-CM的免疫调节潜力
- 准备完整的脾细胞中,它由罗斯维尔公园纪念研究所(RPMI)-1640培养基补充有10%热灭活FBS,1×青霉素 - 链霉素,2-巯基乙醇。过滤消毒网上平台。
- 从安乐死-雄性BALB / c小鼠收获脾脏,通过在腹部的左侧在脾脏制备的切口,前之间大约中途和后腿14。转移脾70微米的细胞过滤分离脾14。
- 通过推动通过70微米的过滤器脾脏到无菌培养皿全光照隔离脾细胞/淋巴细胞克软橡胶/塑料柱塞从2-3结束毫升注射器14。使用磨转圈分离脾脏。
- 用冷PBS洗细胞过滤几次,然后从培养皿转移细胞到50ml锥形管中。在4℃下填充用冷PBS离心(500 XG)的管10分钟。
- 吸出上清液,并从红细胞温育用5-10毫升红细胞溶解溶液(每脾)5-10分钟清除细胞。
- 通过加入冷PBS到管和离心机在500 xg离心5-10分钟,并在4℃停止裂解。
- 暂停在完整脾细胞培养基中分离细胞,通过40微米的过滤器进行过滤,并使用血球计数细胞。脾细胞培养基添加到细胞悬浮液达到10 6个细胞/ ml的最终细胞浓度
注:此方法通常会产生每只小鼠脾约3×10 7脾细胞。 注:脾细胞的量需要取决于如由研究者测定的实验条件的数目(见步骤6.9)。对于每一个实验样品/孔,需要10 6脾细胞。 - 转移10 6脾细胞(刺激或非刺激的)转换成一个12孔板的孔中,并添加非条件(对照)或MSC-CM成以1最终稀释孔:10-1:20。
- 收获后24小时,离心分离脾细胞的CM,在500×g离心,在室温下5分钟。
- 按照制造商的说明商业ELISA试剂盒将上清转移到新的管中,测定为干扰素γ(IFN-γ)的内容。
7.前列腺癌检测,以评估球体-CM的抗癌潜力
- 制备完全RPMI生长培养基是补充有10 RPMI-1640培养基%FBS,1×青霉素 - 链霉素。
- 获得的LNCaP前列腺癌细胞的冷冻小瓶中并孵育小瓶2分钟在37℃水浴中。
- 转移小瓶的内容到装有30ml使用机动移液器完全RPMI生长培养基和5ml的血清吸管培养皿。与从盘介质洗小瓶几次并将培养皿放入孵化器。
- 细胞达到汇合之前,用室温的PBS洗培养两次,并用3毫升预热0.25%胰蛋白酶/ EDTA溶液的分离LNCaP细胞。
- 中和与完全RPMI生长培养基皿的胰蛋白酶,将细胞用洗涤转移一起到50毫升锥形管中。
- 离心细胞,在450×g离心在室温下10分钟,吸出上清液。
- 重悬浮细胞进入完全RPMI生长培养基的体积小,并使用血细胞计数器计数的癌细胞。
- 以执行使用细胞增殖测定试剂盒,细胞生长测定中,吸从井介质和板转移到冷冻(-80℃)下至少3小时。
- 解冻板并井加入100微升含有180 mM氯化钠,1mM的EDTA和0.2mg / ml的核糖核酸酶A.细胞裂解试剂溶解在每个单元
- 对于标准曲线,如上所述裂解已知量LNCaP细胞的。
- 1小时后,添加100微升含1 1×细胞裂解缓冲液:100稀释细胞增殖测定试剂,并测量荧光每个孔中,以确定细胞数量。
8.完整的球体腹腔交付
- 上面(协议2),重悬T作为描述的准备球体干细胞他球体无菌汉克的补充有0.2-0.5%的HSA保持XF条件平衡盐溶液(HBSS)中。 HSA的溶液有助于防止注射期间球粘附于塑料。
- 转移40-120球状体分为15毫升锥形管中,并通过加入6毫升HBSS / HAS到管洗涤细胞。允许3-4分钟的球下降。准备球状体每只动物的一个独立的锥形管中。此外,对于试验确定球体保留(见下文8.18)和转移后生产的治疗因素(见下文8.19),如果需要,准备球体的额外管。
- 吸出上清液,用100-200微升无菌的HBSS补充有0.2-0.5%的HSA叠加球体,并将管在冰上。
- 简要地麻醉用在100%的氧气2%异氟醚将动物直至捏趾反射的消失在感应室约2分钟。
- 将动物的BSL-2柜,背里面ASPECT下(腹朝上),1.5%异氟醚/氧气混合物通过鼻锥的连续流。
- 请用消毒剂如70%酒精下鼠标腹部。
- 除去20G的静脉内(IV)导管的帽并与导管打孔组件执行腹膜内注射。用一只手按住鼠标皮肤,另一个进行注射。定位大约在连接与针尖朝向中线指向一个弯曲膝关节和生殖器区域人造线的中间注入点。
注:导管细总成具有比普通针较高的耐药性,因此保健已采取不注射针过深到腹部,这可能导致伤害内脏。皮肤的渗透,然后肌肉/腹膜可以导管放置过程中显现出来。 - 轻柔地从导管细组装金属打孔/针。 CHECK代表血液,尿液和粪便的细高跟,并丢弃它。在针血液表示内部器官(多个)的穿刺。
- 持注射期间在直立位置的塑料导管,以允许流体流动。
- 通过使用移液管有100-200微升末端通过导管注入大约100微升无菌HBSS / HAS的确认塑料导管的适当的位置。放置导管注射器适配器形成紧密的密封内部枪头的末尾。缓缓注入腹腔内的流体。
注:在正确定位导管流体将腹腔内自由流动,只有导管的微小调整。导管的放置不当(皮下或肠内,或者如果针受伤腹膜器官如肾脏的尖端)会增加电阻,降低流动。皮下放置会导致形成皮肤下面有明显的“泡沫”。 - 收集ŧ他MSC球状体,在100-200微升HBSS / HAS(步骤8.3)的制备,用200μl移液管尖端,并如上所述通过导管转移球的总体积(40-120球)进入腹膜腔。
- 洗用与上述相同的尖端来收集任何残留的球状体,并将它们注入到腹膜腔中含有用100μlHBSS / HAS的球管。
- (可选)注入另外100微升HBSS / HAS的进入腹膜腔洗导管。
- 放置在防腐剂在导管浸泡的纱布垫,慢慢从腹腔取出导管,并丢弃它。
- 轻轻按摩用手指腹膜腔,以确保即使在球状体的分布。
- 让动物密切监督下恢复,并注意从注射部位出血。
- 检查任何剩余球体导管和15ml管中。这是正常现象,观察在几个领域导管/管。
注:MSC球体递送描述的技术可以用于在正常动物或在各种损伤模型的使用被采用。该技术已成功地用于注射在小鼠角膜损伤和内毒素血症模型的球体,以及在酵母聚糖诱导的腹膜炎模型8。 - 为了量化保留球体(可选)的数量,使用基于DNA的细胞数量定量试剂盒/试剂。持在15ml试管中的用于导管和穿过导管大力分配的HBSS / HAS迫使任何剩余的球回15ml试管。
- 离心15ml试管在500 xg离心在室温下5分钟,吸出上清液。传送含有球体粒料管成冷冻(-80℃)下至少3小时。
- 解冻管并通过加入500微升含有180 mM氯化钠,1mM的EDTA和0.2mg / ml的核糖核酸酶A.细胞裂解试剂裂解球体
- 对于控制,FRE结和裂解球状体的已知量(优选相当于用于单个注射制备球状体的数量),如上所述。
- 1小时后,转移100μl的细胞裂解物中的,一式两份,在96孔微量培养板,并加入到每孔100μl含有来自试剂盒1:50稀释的细胞增殖测定试剂的1×细胞裂解缓冲液中。 10分钟后,测量荧光每个孔中,以确定未由实验样品(多个)与对照样品进行比较注射球体的数目。
- 评估通过测量转移球产生的PGE2的浓度和TSG6注射(可选)准备球状体的激活水平。转印40-120球通过导管中,如上所述,为含有1或2毫升αMEM补充有2%FBS和1x青霉素/链霉素12孔或6孔平板。放置在孵化器板6小时。
- 传送自介质孔后6小时到1.5或15ml试管并在450 xg离心离心管在室温下5分钟。
- 传送用吸管和离心机的无细胞上清液到新的1.5毫升管以10,000rpm XG在室温下5-10分钟。
- 转移澄清CM(上清液)到新的1.5毫升管和测定使用根据制造商的说明商业ELISA试剂盒的PGE 2浓度(CM的抗炎潜力的良好的指标)。可以使用发布的协议14来决定TSG6浓度。
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Representative Results
在目前的工作中,采用悬滴文化生成球形紧凑微型组织或XF条件下激活干细胞的“球体”。 图1中的试验用路线图描绘的MSCs被鼓励自组装悬浮于悬滴72小时,在此之后,球状体,或在CM装入球体源性治疗因子时变成球体,可以收集和潜在地在两个利用研究和临床应用。大量需要的球生产细胞可以在一个星期内通过以低密度接种的干细胞,通常100-200细胞每厘米2,然后扩大细胞6-7天,直到约80%汇合( 图2中可以获取)。细胞生长动力学,按每日计数活细胞确定,表明稳健扩张阶段(3-7天)以下的1-2天短暂的滞后期( 图2C </ STRONG>)。在通路2或3的MSC通常得到从100万冷冻保存的细胞时于CCM中培养的单个小瓶50-100百万个细胞。
继扩张和收获的干细胞在高细胞浓度悬浮产生的球体,每微升通常500-1000细胞。悬滴培养物通过将含有干细胞介质的25-40微升液滴到组织培养皿盖,随后翻转并适当地定位在盘的底部( 图3)的下侧制备。当以每微升714细胞悬浮在CCM 35微升液滴( 即每滴25,000个细胞),间充质干首先组装成小聚集,最终合并在下降( 图3C)的顶点72小时,以产生一个紧凑球体。球状体也形成了72小时的几种类型为MSC扩容优化市售XF媒体,此处称为XFM-1和XFM-2。然而,在XFM-1形成一个紧凑的球的要求补充13毫克/毫升人血清白蛋白(HSA),反映在CCM中所估计的总蛋白含量( 图3D)的浓度。单紧凑球体不容易在基本XFM-1形成没有HSA或在无蛋白质αMEM( 图3D)。期间球体装配,MSC表型的变化自由基( 图4),并且当在适当的化学成分确定的XF介质( 即 XFM-1 +,HSA),许多抗炎因子的表达被上调,包括PGE2和TSG6( 图4C)。然而,生产TSG6和PGE2的不显着地增加在XFM-2或XFM-1为球体培养的MSCs没有HSA( 图4C)。值得注意的是这些抗炎因子,以及抗癌因子TRAIL和IL-24,被高度上调在球体的MSC相对于单层的MSC,叔当他球体在补充有从人血( 图4D)中制备任一重组体HSA(的rHSA)或临床级的HSA(CHSA)XFM-1中培养。
为了评估在各种媒体制剂制备的MSC球体的治疗潜力,几个实际测试被执行( 图5)。球状体的免疫调节性质首先在体外通过测量由LPS刺激巨噬细胞和CD3刺激的脾细胞/淋巴细胞( 图5)产生的细胞因子的水平的球CM的效果来确定。从MSC CM球体在CCM和XFM-1 / HSA显着地抑制生产的巨噬细胞的TNFα和脾细胞的IFNγ培养,而在同一时间增强抗炎细胞因子的IL-10水平( 图5A和5B)。球体的抗癌特性通过测量球的CM 0的效果评价Ñ生长和LNCaP前列腺癌细胞的形态。对于XF介质XFM-1 / HAS有效地减少类似于含FBS的CCM( 图5C和5D)的LNCaP细胞增殖。
重要的是,完整的MSC球体可以施用到小鼠的腹腔内,以测试所述细胞在体内的抗炎活性( 图6)。对于这些实验,球体注射制备在HBSS含HSA的浓度低,它自己的粘附最小化的塑料管,同时保持一个XF状态。接着,球体可以容易地从收集管( 图6A)转印后注射,用吸管( 图6B),通过针/导管组件( 图6C和6D)适当定位为一个标准的腹膜内注射。使用这种方法,MSC球体可定期在一个效率大于90%( 图6E和6F)而不破坏它们的完整性( 图6G和6H)传送。腹腔内的导管末端的定位不当导致球体输送差和高的维持率( 图6F)。重要的是,吸液管/导管内球保持的水平可以定性通过视觉检查确定,或定量通过收集/裂解保留球体和测量与市售的DNA为基础的细胞定量试剂/试剂盒( 图6F)的细胞数。注射后球体保留分析有助于实验过程中创建纳入/排除标准。值得注意的是,对于CCM和XFM-1 / HAS球体分泌高水平TSG6和PGE2的能力是从悬滴培养物( 图6I)球体的转印之后保持至少6小时。类似于其在体外 EFfects,XFM-1 / HAS球体注射到小鼠的腹腔内,之后立即通过脂多糖静脉给药,增强PGE2和IL-10水平的全身炎症的诱导腹膜同时降低促炎性TNFα( 图6J)。
图1:为利用底漆作为XF条件下的球形微组织的MSCs的分泌组开发的平台的示意图。如下扩展作为单层培养物(1),所述的MSC悬浮于在高细胞浓度从培养皿(2)的盖悬滴激活/素细胞。 72小时后,无论是(3)的条件培养基(CM)和(4)完整球体可以从液滴被收获并在各种下游应用使用。在CM富含免疫调节因子,以及其它治疗COMPON经济需求测试。在悬滴形成致密的球体可以使用移液管(5)和有效地在体内施用通过导管(6)很容易地转移。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2:在单层培养骨髓来源的MSC的生长特性。在通道2的MSC以低密度15厘米培养皿(每皿15,000个细胞)和7天在CCM中培养的接种( 每平方厘米100个细胞)。换液第3天,然后再在5天或第6(前收获24-48小时)。电镀细胞后的MSC 3天(A)和7天(B)的代表性的相差显微镜照片。比例尺= 200微米。 (C)干细胞的生长动力学从3个供体获得由第2天计算,每天活贴壁细胞的数量,7天决定请点击此处查看该图的放大版本。
图3:悬滴文化为XF中吸MSC球体的制备。 (A)照片描绘技术快速层挂在组织培养皿的盖子的下侧滴。 (B)的照片示出挂倒置和盖的定位到盘基后下降。 (C)在25000干细胞作为可视化用相差显微镜悬滴聚集随时间的变化。我们的目标都集中在下降的顶点。比例尺= 500微米。 (D)伊马MSC球体GES后悬挂使用各种介质制剂,包括αMEM有和没有FBS的( 即 ,CCM),XFM-1有和没有HAS,和XFM-2有和没有HSA滴培养3天形成。比例尺= 200微米。面板D数据均来自出版商14许可的原创文章获得。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4:3-D XF文化MSC激活评价。 (A)球/ CM都在72小时后通过颠倒/倾斜盘盖子,并用细胞升降机迫使液滴边缘的收获。从25,000个细胞聚集球可收集过程中不易观察。 (B)approxi的照片三方共同从众多的组织培养皿的盖子收集500个球。球体迅速下降到试管底部不离心。 (C)的PGE 2的水平从MSC球体72小时,通过ELISA测定后分泌的。实时RT-PCR法用于测量TSG6水平。无论TSG6和PGE2是在球体筛选MSC激活宝贵的标记。该XF中XFM-1 + HSA表明PGE2和TSG6生产(红色框)的较高水平。数据显示为平均值±SD和由学生t检验进行分析(*** P <0.001,相对于αMEM样品)。 (D)在CCM和XFM-1 13毫克/毫升的重组HSA(的rHSA)特异性补充产生球体PGE 2 ELISA和实时RT-PCR测定法,或从人静脉血制备临床级的HSA(CHSA)。从单层贴壁的MSC(RQ = 1)测定倍数变化。数据显示为平均值±SD和由学生t检验进行分析(** P <0.01,*** P <0.001,相对于单层MSCS)。从出版商14许可的原创文章,获得在面板C和D的一些数据。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5: 在体外功能测定,用于评估从悬滴培养物中收集的MSC-CM的抗炎和抗癌特性。 (A)从ELISA中示出对生产TNFα和IL-10的球体的CM(CCM和XFM-1 / HAS)通过LPS刺激小鼠巨噬细胞(MQ)的影响的代表性结果。 (B)选自ELISA代表性的结果表示由用抗CD3抗体刺激的小鼠脾(SPL)生产的IFNγ球体CM(CCM和XFM-1 / HAS)的效应。与来自在CCM和XFM-1 / HAS制备的MSC球体基本CCM和XFM-1 / HAS或条件培养基(CM)处理的LNCaP前列腺癌细胞(C)的相衬显微镜照片。将LNCaP细胞在RPMI培养基(对照)中培养。比例尺为200微米。在将LNCaP前列腺癌细胞的生长(D)的定量变化,用市售的基于DNA的细胞定量试剂/试剂盒测定。虚线表示每孔5,000个细胞的接种密度。在所有面板数据显示为平均值±SD,以及由学生t检验(*** P <0.001)进行了分析。从出版商14许可的原创文章,获得在所有面板的一些数据。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图6:完整的干细胞球体,XF条件下制备,使用20G IV针/导管系统的高效传输。 (A)和含有0.2%HSA的HBSS注射制备XFM-1 / HAS MSC球体15毫升锥形管的代表性照片。 (B)代表照片的愿望后,MSC球入200微升的枪头。 (C)用于管理完整MSC球体到小鼠各20 g针/导管组件的图像。 (D)图像证实枪头的适当定位到聚氨酯导管的适配器。将它们通过导管插入培养皿后立即(E)的MSC球的形象。大约95球满分100转移。球输送(F)的效率到小鼠的腹腔内被收集保留在/裂解球体确定吸管/导管和测量细胞数目,经由商用基于DNA的细胞定量测定中,相对于从裂解球体的全长互补获得的细胞的数量。红色虚线表示的90%的转印效率。差球体输送(71%)与一个喷射(箭头)观察到。 (G)在图E领域的相衬显微照片(放大显示)。比例尺= 200微米。 (H)转移到一个组织培养皿后XFM-1 / HAS球体16小时的相衬显微照片。 MSC的成纤维细胞,纺锤形的形态被保持在该迁移出球的细胞。比例尺= 200微米。 (Ⅰ)的ELISA测定法TSG6和PGE2分别对CM执行的抗炎因子转印球体的成含2mlαMEM/ 2%FBS中的6孔板之后收集6小时。在XF中XFM-1制备球/ HSA表明TSG6和PGE2分泌(红色框)的最高水平。数据表示为平均值±SD,经学生t检验分析(*** P <0.001,相对于αMEM样品)。有些数据是从出版商14许可的原创文章获得。 (J)代表曲线示出球状体的能力,注入到腹膜腔中,以增加腹膜PGE 2和IL-10,而在由内毒素静脉内注射(LPS)的攻击的小鼠降低TNFα的水平。样品通过腹腔灌洗6小时炎症和80球状体递送诱导后得到的。数据,表示为平均值±标准差,通过学生t检验进行分析(* P <0.05,** P <0.01,与对照相比)。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在一些研究和临床应用中使用的最佳的MSC应高度活化以最大化他们的利益,和化学成分确定的XF的条件下优先制备,以尽量减少潜在抗原从异种介质组分如胎牛血清的交付。在这里所描述的协议中,我们已经表明方法1)通过形成球状体的激活在三维培养的MSC,2)实现的MSCs XF条件下的3D激活,3)评价在关于他们抗球体MSCs的激活水平抗炎,免疫调节和抗肿瘤潜力,和4)提供激活的MSC作为完整的球体到小鼠。
的MSC是可以通过塑料吸附从众多成人组织包括骨髓和脂肪组织中分离的多能干细胞。干细胞很容易在组织培养塑料在相对较高(10-20%)FBS浓度传播,表达一组不同的表面标志物,并至少可以分化成脂肪形成,成骨和软骨形成细胞系1,16,17,18。的MSC已经证明施加在人类疾病的多种动物模型的有益效果,尽管它们似乎它们在体内施用后仅短暂存在。因此MSC的作用被称为“击中和运行”通常是由抗炎和免疫调节旁分泌因子,如PGE 2,TSG-6,和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO),通过的MSC 2分泌介导的,3,11,19,20,21。然而,为了生产这些因素,干细胞需要激活,无论是通过从受损组织的信号,或从免疫Ç收件人的厄尔。随后,出现了输送细胞成动物或患者22之前开发的MSC预活化或引发协议一个新兴的兴趣。此外,抗原FBS成分的标准MSC制剂的存在已引起关注。因此,研究已经进行,以确定的MSC培养物的最佳化学上确定的XF条件。在我们最近的工作中,我们首先表明,干细胞可以在三维通过形成球状体被激活,然后发现细胞的活化也可以具体XF条件8,12,13,14下实现。
三维细胞培养技术已经使用了几十年与提供在基于细胞的研究真正的生理条件的目标。在2D培养无视组织的三维性质,因此不总是概括细胞 - 细胞和细胞 - 基质的相互作用在细胞信号很重要。许多3D培养技术使用旋转容器,旋转烧瓶,或各种非粘附表面上,然而,在许多这些方法的最大缺点是所产生的椭圆体的尺寸和/或特定的昂贵的设备的需要的异质性。研究也已使用悬滴培养物基本上鼓励的MSCs进行自发聚集成一个单一的球状体4,5,6,7,8,9,23。值得注意的是,悬滴培养支持相对均匀的微组织/聚集体的组件,具有能够容易地通过调节细胞浓度和/或滴体积操纵细胞聚集体的尺寸的好处。此外,悬挂的D掌握ROP培养技术不需要大量的训练。 25-40微升滴用高浓度的细胞,每微升通常500-1000间充质干细胞很容易制备。滴小于20微升倾向于迅速蒸发,而那些大于45微升经常反转期间横跨盖子涂抹。然而,翻转含有任何大小,速度和方向的液滴的盖时,需要考虑用于保持表面张力和下拉/球体的适当形状的关键参数。在孵化器不间断文化和适当的气流也是保证干细胞聚集成每一滴在一个单一的领域非常重要的。
这种技术的一个缺点是,含有悬滴板不应在培养箱堆叠或球形组装过程中移动,使得扩大为困难的病人的治疗方法。此外,在悬滴培养变换媒体是极具挑战性的,因此长期培养物应该是AVoided。此外,低媒体至细胞比率在悬滴可引起营养耗竭和废物积累最终导致重要的细胞功能和/或细胞死亡的损失。
然而,在适当的悬滴技术,我们已经表明,在球状体的MSC成为高活性或底漆,在这些细胞成为有力的抗炎分子PGE2和TSG6,以及抗癌分子IL-24和工厂落后。我们已经表明,MSC球状体确实抗炎和免疫调节,并具有优于使用培养的巨噬细胞,脾细胞和前列腺癌细胞8,12,13,14在众多功能测定其2D单层同行抗癌特性。此外,我们已经表明,施用时的MSC球状体可以发挥强效的抗炎作用到小鼠腹膜炎8腹膜腔。具体地说,我们发现,在直径约为400-500微米的大球体(各25,000-30,000的MSC)能够有效地在HBSS中的一小体积使用20G针/导管组件和一个标准移液管递送。利用这种技术,不正确的导管放置,这导致了高的耐流体流,可事先容易地确定通过如在协议中所述第一注入的HBSS / HAS的一个小体积球体转移。在一个适当定位的导管的球体将自由流动,只要该HBSS补充有HSA到球粘附最小化对塑料管,并且可以容易地可视化。此外,该技术可以防止在其上可以发生使用用于注射的标准针/注射器细胞的剪切应力,并避免了手术切口携带感染的风险更高,更技术上具有挑战性的需要。一个主要的缺点是叔帽子大量球状体只能被注入到宽敞体腔,如腹腔,作为对球体转移的阻力,通过该导管是在缩区域高。
我们最近还证明MSC活化在球状体相同的水平可以通过使用特定的市售XF介质来实现,在此称为XFM-1,只要它是补充有HSA人血液获得或制备通过重组技术14。重要的是要在这里指出,MSC球状体不产生在所有类型的XF媒体14的高水平PGE2和TSG6的,可能是因为对干细胞最XF媒体最初配制用于2D细胞的最佳扩充。同样重要的是要注意,不同类型的HSA在其效力14而有所不同。此外,PGE 2的绝对水平在活化球状体的CM检测可以变化轻微LY为PGE2采用ELISA确实是竞争分析。因此,关键的是要包括在每PGE 2 ELISA适当的控制,并避免直接比较在不同时间测定样品之间或在不同的板的数据。此外,干细胞必须彻底在XF培养基洗涤之前制备悬挂以除去残留的CCM和,因此,FBS组分的极限结转下降。这里所描述的协议,可以很容易地通过评价对球形成和治疗基因表达等培养基配方。
显然,通常不发生在二维的MSC众多细胞信号事件在运动时的MSC是在三维培养的设定。细胞-细胞和细胞-基质相互作用,由钙粘蛋白和整联导引球体形成和压实24,25,26介导的,并且是球体治疗可能是至关重要的。作为细胞聚集体和共MPACT成球状体,各种应激信号,包括次要凋亡,援助在MSC活化的过程,其导致生产大量潜在的治疗因素4,5。我们以前表明自分泌IL-1的信号在MSC活化和生产PGE2和TSG6 12的关键作用。虽然还有许多未知有关的各种信号通路的激活MSC援助,悬滴文化的平台,提供了一个切实可行的方法来研究这个现象,提高基于MSC的疗法。总体而言,我们所描述的,在这里所述的协议,化学成分确定的XF条件下激活或在3D培养吸的MSC,手段,以产生抗炎,免疫调节和抗肿瘤的因素。我们还描述了如何将这些完整的MSC球状体可以在体内递送。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
(-80 °C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
12-well plate | Corning | 3513 | in vitro macrophage stimulation |
LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | in vitro splenocyte stimulation |
70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.) |
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
References
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