Kwantificering van bacteriële histidine kinase autofosforylering Met een Nitrocellulose bindingsassay

Summary

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Abstract

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

Introduction

Adaptieve respons is essentieel voor de overleving van bacteriën. Op te sporen en te reageren op veranderingen in het milieu, bacteriën gebruiken een stimulus-respons systeem bekend als tweecomponenten signalering. ^1,2 In een typisch twee-componentensysteem, histidine kinase detecteert verwante stimulus, autophosphorylates de geconserveerde histidine residu vervolgens overdraagt fosfaat een geconserveerde aspartaat residu op de ontvanger domein van een response regulator eiwit. ³ Deze gebeurtenis veroorzaakt een verandering in de activiteit van de response regulator, die een stroomafwaarts effect stimuleert. ^4,5 Aldus bacteriën kunnen detecteren en aanpassen aan wijzigingen in de lokale omgeving. Sommige tweecomponenten signaleringssystemen afwijken archetype. In sommige gevallen, de zintuiglijke domein van de histidine kinase is een stand-alone-eiwit, die direct detecteert de zintuiglijke en wijzigt kinase activiteit door middel van eiwit-eiwit interactie. ^6-8 Echter, het fondsamental werkwijze en algemene rol van het systeem blijft hetzelfde. Tweecomponenten signalering is een alomtegenwoordige stimulus-respons systeem dat essentieel is voor bacteriële overleving en histidine kinasen spelen een belangrijke rol in de transductie van het signaal. ⁹

Ondanks het belang van histidine kinases bacteriële biologie, blijven ze slecht gekarakteriseerd. Dit komt door de inherente instabiliteit van phosphohistidine en het ontbreken van een praktische werkwijze voor het meten van autofosforylatie. Phosphohistidine meer labiele dan fosfoserine, fosfotreonine en fosfotyrosine. ¹⁰ Dus, technieken die vaak worden gebruikt om Ser / Thr / Tyr kinases analyseren gelden niet voor histidine kinases. ¹¹ In vitro assays histidine kinases bestuderen grotendeels beperkt tot SDS PAGE-autoradiografie. ^12,13 Bij deze werkwijze [γ- ³² P] -ATP geïncubeerd met de kinase en fosforylering van het kinase wordt geanalyseerd door polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) gevolgd door autoradiografie van het gel. Deze methode kan worden gebruikt voor het kinase autofosforylering en fosfotransfer van het kinase beantwoord regulator controleren. Deze werkwijze heeft opmerkelijke tekortkomingen. PAGE-gebaseerde testen zijn lage doorvoer en tijdrovend. Dergelijke beperkingen zijn niet bevorderlijk voor het karakteriseren van een eiwit en het vaststellen van de kinetische parameters. Een alternatieve methode voor het bestuderen histidine kinases die onlangs gepubliceerd werd gebruikt phosphohistidine antilichamen autofosforylering detecteren. ¹⁴ Hoewel deze methode heeft het voordeel van onderscheid tussen 1-en 3-phosphohistidine phosphohistidine, afhankelijk van de instrumentatie gebruikt voor detectie, kan deze methode niet over een groot dynamisch bereik of high bovenste detectiegrens. Er is dus behoefte aan een snellere, minder arbeidsintensief en meer gevoelige test die kan worden gebruikt om deze belangrijke eiwitten te bestuderen.

We beschrijven hier en demonstrate een zorgvuldig ontwikkeld nitrocellulose bindingstest die gebruikt kunnen worden om autofosforylering van gezuiverde bacteriële histidine kinases in vitro kwantificeren. Deze test is een hogere doorvoersnelheid en minder tijdrovend dan PAGE gebaseerde testen. De werkwijze gebruikt ook Cherenkov straling phosphohistidine kwantificering, die een hoge bovengrens van detectie en een groot dynamisch bereik heeft. De test kan worden gebruikt om kinetische parameters voor histidine kinases bepalen.

Protocol

Let op: Dit protocol vereist een passende opleiding in het gebruik en de verwerking van radioactief materiaal. Gebruik de vereiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het uitvoeren van deze test, met inbegrip van beta-straling afscherming. Radioactief afval moet zorgvuldig worden behandeld, als grote hoeveelheden afval worden gegenereerd tijdens het wassen fase van het experiment. Zorg ervoor dat het afval wordt opgeslagen in een rechtopstaande container, zoals een grote emmer of een fles die zal niet gemakkelijk over worden geslagen of g…

Representative Results

Een representatieve gegevens set werd gegenereerd die een beeld vastgelegd met een fosfor-imager (figuur 1), Ponceau S kleuring van de nitrocellulose membraan (figuur 2), en scintillatietelling data (figuur 3). Figuur 3A toont het enzym kinetische constanten in een Lineweaver-Burk plot. Deze resultaten werden verkregen met een gezuiverd histidine kinase van de gram-negatieve species Vibrio parahaemolyticus…

Discussion

De nitrocellulose bindingstest we hebben beschreven heeft vele voordelen ten opzichte van eerder gebruikte werkwijzen om histidine kinases karakteriseren. In vergelijking met traditionele SDS / PAGE-autoradiografie gebaseerde, onze werkwijze hogere doorvoer en minder tijdrovend. Het nitrocellulosemembraan gemakkelijker te hanteren dan SDS gels en hoeft niet te worden vastgesteld. Ponceau kleuren van de nitrocellulose maakt de eiwitvlekken worden gevisualiseerd. Dit biedt een eenvoudige manier uit te snijden elke plek vo…

Materials

Phosphoric acid	VWR	AAAA18067-AP	For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base	RPI	T60040-5000.0	Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride	RPI	P41000-2500.0	For kinase reaction buffer
Magnesium chloride	RPI	M24000-500.0	For kinase reaction buffer
Glycerol	RPI	G22020-4000.0	For kinase reaction buffer
5'-ATP	Promega	E6011	Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP	Perkin Elmer	NEG002Z250UC	6000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus	Bio-rad	1706545	For spotting reactions
Nitrocellulose	Whatman	32-10401396-PK	For spotting reactions
Ponceau S	Sigma aldrich	P3504-50G	For staining nitrocellulose