Quantificação dos Quinase bacteriana Histidina Autofosforilação utilizando um ensaio de ligação de nitrocelulose
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
A resposta adaptativa é crucial para a sobrevivência das bactérias. A fim de detectar e responder a alterações ambientais, as bactérias utilizam um sistema de estimulo-resposta conhecido como sinalização de dois componentes. 1,2 Em um sistema de dois componentes típica, a histidina quinase detecta um estímulo cognato, autophosphorylates seu resíduo histidina conservada, em seguida, transfere fosfato para um resíduo aspartato conservado no domínio receptor de uma proteína reguladora da resposta. 3 Este evento provoca uma alteração na actividade do regulador de resposta, que estimula um efeito a jusante. 4,5 Assim, as bactérias são capazes de detectar e adaptar-se a mudanças no meio ambiente local. Alguns sistemas de sinalização de dois componentes afastem deste arquétipo. Em alguns casos, o domínio sensorial da histidina-quinase é uma proteína autónoma, que detecta directamente a entrada sensorial e modifica a actividade de cinase através de uma interacção proteína-proteína. 6-8 No entanto, o fundoamental processo e o papel global do sistema continua a ser a mesma. sinalização de dois componentes é um sistema de estímulo e resposta ubíquo que é essencial para a sobrevivência das bactérias, e histidina-cinases desempenham um papel crucial na transdução do sinal. 9
Apesar da importância das cinases de histidina a biologia bacteriana, permanecem pouco caracterizados. Isto é devido à instabilidade inerente do fosfo-histidina, e a falta de um método prático para medir a autofosforilação. Fosfo-histidina é mais lábil do que o fosfo-serina, fosfotreonina, fosfotirosina e. 10 Assim, as técnicas que são comumente usados para analisar quinases Ser / Tre / Tir não são aplicáveis para cinases histidina. 11 Os ensaios in vitro para estudar histidina-cinases têm sido largamente limitado a auto-radiograf ia de SDS-PAGE. 12,13 Neste método, [γ- 32 P] -ATP é incubada com a quinase e fosforilação da cinase é analisada por Polelectroforese em gel de yacrylamide (PAGE) seguido por autorradiografia do gel. Este método pode ser utilizado para monitorizar a autofosforilação da quinase, bem como phosphotransfer da quinase a um regulador de resposta. No entanto, este método possui limitações notáveis. ensaios à base de página são baixo rendimento e demorado. Essas limitações não são conducentes a caracterização de uma proteína e determinar seus parâmetros cinéticos. Um método alternativo para o estudo de quinases de histidina que foi publicada recentemente utiliza anticorpos fosfo-histidina para detectar a autofosforilação. 14 Enquanto este método tem a vantagem de distinguir entre 1-fosfo-histidina e 3-fosfo-histidina, de acordo com a instrumentação utilizada para a detecção, este método não podem oferecer uma grande gama dinâmica alta ou limite superior de detecção. Assim, existe uma necessidade para um ensaio mais rápido e menos trabalhoso, e mais sensíveis que podem ser utilizados para estudar estas proteínas importantes.
Aqui, descrevemos e demonstrate um ensaio de ligação de nitrocelulose cuidadosamente desenvolvidas que podem ser usadas para quantificar a autofosforilação de histidina-cinases de bacterianas purificadas in vitro. Este ensaio é um maior rendimento e menos demorada do que ensaios baseados em PRINCIPAL. O método também utiliza radiação Cherenkov para quantificação fosfo-histidina, que proporciona um elevado limite superior de detecção e um grande alcance dinâmico. O ensaio pode ser usado para determinar os parâmetros cinéticos para a histidina-cinases.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de ligação de nitrocelulose temos descrito tem muitas vantagens sobre os métodos anteriormente utilizados para caracterizar quinases histidina. Em comparação com SDS / autorradiografia tradicional à base de PAGE, o nosso método é maior rendimento e menos demorado. A membrana de nitrocelulose é mais fácil de manusear do que geles de SDS, e não precisa de ser fixo. Ponceau manchando a nitrocelulose permite que os pontos de proteínas a ser visualizado. Isso fornece uma maneira fácil de cortar cada loc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Educação através da Assistência Pós-Graduação em Áreas de programa de necessidade nacional (P200A100044).
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
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