La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
respuesta de adaptación es crucial para la supervivencia bacteriana. Con el fin de detectar y responder a los cambios ambientales, las bacterias utilizan un sistema de estímulo-respuesta conocida como señalización de dos componentes. 1,2 En un sistema de dos componentes típico, la histidina quinasa detecta un estímulo cognado, autophosphorylates su residuo de histidina conservado, a continuación, transfiere el fosfato a un residuo de aspartato conservado en el dominio receptor de una proteína de regulador de la respuesta. 3 Este evento desencadena un cambio en la actividad del regulador de la respuesta, que estimula un efecto aguas abajo. 4,5 Por lo tanto, las bacterias son capaces de sentir y adaptarse a los cambios en el medio ambiente local. Algunos sistemas de señalización de dos componentes se desvían de este arquetipo. En algunos casos, el dominio sensorial de la histidina quinasa es una proteína independiente, que detecta directamente la entrada sensorial y modifica la actividad de quinasa a través de una interacción proteína-proteína. 6 – 8 Sin embargo, el fondoamental proceso y el papel global del sistema sigue siendo el mismo. señalización de dos componentes es un sistema de estímulo-respuesta omnipresente que es esencial para la supervivencia bacteriana, y histidina quinasas juegan un papel crítico en la transducción de la señal. 9
A pesar de la importancia de la histidina quinasas a la biología bacteriana, siguen siendo mal caracterizado. Esto es debido a la inestabilidad inherente de fosfohistidina, y la falta de un método práctico para la medición de la autofosforilación. Fosfohistidina es más lábil que fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina. 10 Por lo tanto, las técnicas que se utilizan comúnmente para analizar quinasas Ser / Thr / Tyr no son aplicables para histidina quinasas. 11 ensayos in vitro para el estudio de histidina quinasas en gran medida se han limitado a autorradiografía SDS-PAGE. 12,13 En este método, [γ- 32 P] -ATP se incuba con la quinasa, y la fosforilación de la quinasa se analiza por polelectroforesis en gel de yacrylamide (PAGE) seguido por autorradiografía del gel. Este método puede ser usado para monitorear la autofosforilación de la quinasa, así como phosphotransfer de la quinasa a un regulador de la respuesta. Sin embargo, este método tiene notables deficiencias. Los ensayos basados en páginas son de bajo rendimiento y consume mucho tiempo. Tales limitaciones no son propicias para la caracterización de una proteína y la determinación de sus parámetros cinéticos. Un método alternativo para el estudio de quinasas de histidina que fue publicado recientemente utiliza anticuerpos fosfohistidina para detectar la autofosforilación. 14 Si bien este método tiene la ventaja de distinguir entre 1-fosfohistidina y 3-fosfohistidina, dependiendo de la instrumentación utilizada para la detección, este método puede no ofrecer una amplia gama dinámica o límite superior alto de detección. Por lo tanto, hay una necesidad para un ensayo más rápido, menos laborioso y más sensible que puede ser utilizado para estudiar estas proteínas importantes.
A continuación, describimos ydemonstrate un ensayo de unión de nitrocelulosa cuidadosamente desarrollado que se puede utilizar para cuantificar la autofosforilación de histidina quinasas bacterianas purificadas in vitro. Este ensayo es un mayor rendimiento y menos tiempo que los ensayos basados en páginas. El método también utiliza la radiación Cherenkov para la cuantificación fosfohistidina, que ofrece un alto límite superior de detección y un gran rango dinámico. El ensayo se puede usar para determinar los parámetros cinéticos para la histidina quinasas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de unión de nitrocelulosa que hemos descrito tiene muchas ventajas sobre los métodos previamente usados para caracterizar histidina quinasas. En comparación con / autorradiografía basado-PAGE SDS tradicional, nuestro método es un mayor rendimiento y menos tiempo. La membrana de nitrocelulosa es más fácil de manejar que los geles de SDS, y no necesita ser fijado. Ponceau tinción de la nitrocelulosa permite que las manchas de proteínas para ser visualizadas. Esto proporciona una manera fácil de c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Educación a través de la Asistencia Licenciado en Áreas de programa nacional de Necesidad (P200A100044).
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
References
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