니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
적응 반응은 박테리아의 생존을 위해 매우 중요하다. 검출 및 환경 변화에 대응하기 위해, 박테리아는 이성 신호라고도 자극 – 반응 시스템을 사용한다. 전형적인 2 성분계 1,2-는 히스티딘 키나아제는 동족 자극 검출의 보존 히스티딘 잔기 autophosphorylates 후 반응 조절 단백질의 수신기 영역에 보존 된 아스파 테이트 잔기에 인산을 전송한다. (3)이 이벤트는 하류 효과를 자극 반응 조절제의 활성의 변화를 트리거한다. 4,5- 따라서, 박테리아 감지 지역 환경의 변화에 적응할 수있다. 어떤 두 개의 구성 요소 경보 시스템이 원형에서 이탈. 어떤 경우에는, 히스티딘 키나아제의 감각 영역 직접 감각 입력을 검출하고 단백질 – 단백질 상호 작용을 통해 키나아제 활성을 수정 독립형 단백질이다. 6 – 그러나 8, 펀드amental 처리 시스템의 전체적인 역할은 동일하다. 이성 시그널링은 박테리아의 생존에 필수적이다 유비쿼터스 – 응답 시스템 및 히스티딘 키나제는 신호 전달에 중요한 역할을한다. 9
세균 생물학 히스티딘 키나제의 중요성에도 불구하고, 그들은 가난 특성화 남아있다. 이것은 phosphohistidine의 고유 한 불안정성과 인산화를 측정하는 실제적인 방법의 결여에 기인한다. Phosphohistidine는 포스 포세린, phosphothreonine 및 포스보다 더 불안정하다. 10 따라서, 일반적으로 빼앗아 /의 Thr / 티르 키나제를 분석하는 데 사용되는 기술은 히스티딘 키나제에 대한 적용되지 않습니다. 히스티딘 키나제을 연구하는 11 체외 분석은 크게 SDS-PAGE의 오토 라디오 그래피로 제한되어있다. 이 방법은 12, 13, [γ- 32 P] -ATP은 키나제와 함께 배양하고, 키나제 인산화 POL로 분석yacrylamide 겔 전기 영동 (PAGE)은 겔의 오토 라디오 그래피 하였다. 이 방법은 반응 조절기 키나아제의 인산화 키나아제뿐만 아니라 phosphotransfer을 모니터링하는데 사용될 수있다. 그러나,이 방법에 띄는 결점이있다. 페이지 기반 분석은 낮은 처리량 및 시간 소모적이다. 이러한 제한은 단백질의 특성과 운동 매개 변수를 확인하는에 도움이되지 않습니다. 최근 발표 된 히스티딘 키나아제를 연구하기위한 다른 방법은 인산화를 검출 phosphohistidine 항체를 이용한다. 이 방법은 1, 3 phosphohistidine phosphohistidine 구별하는 이점을 갖지만 (14)는 검출에 이용되는 장비에 따라서,이 방법은 넓은 동적 범위 또는 검출의 높은 상한을 제공하지 않을 수있다. 따라서, 이러한 중요한 단백질을 연구하는데 사용될 수있는 빠르고 덜 힘든, 더욱 민감한 분석이 필요하다.
여기, 우리가 설명하고 D시험관 내에서 정제 된 박테리아 히스티딘 키나아제의 인산화를 정량화하는데 사용될 수있는 니트로 셀룰로오스 신중 개발 결합 분석을 emonstrate. 이 분석은 높은 처리량과 PAGE 기반 분석법보다 시간이 덜 걸린다. 이 방법은 또한 검출 및 큰 동적 범위의 높은 상한을 구비 phosphohistidine 정량 용 체렌 코프 효과를 이용한다. 상기 분석은 히스티딘 키나아제에 대한 운동 매개 변수를 결정하기 위해 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리가 설명했다 니트로 셀룰로오스 결합 분석은 히스티딘 키나제의 특성을하기 이전에 사용 된 방법에 비해 많은 장점을 가지고있다. 전통적인 SDS / PAGE 계 오토 라디오와 비교하여, 우리의 방법은 높은 처리량과 더 짧은 시간이 소요된다. 니트로 셀룰로오스 막을 SDS 겔에 비해 취급이 용이하며, 고정 될 필요는 없다. 단백질 명소가 가시화 될 때까지 니트로 셀룰로오스를 염색 개양귀비 빛이 있?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 필요 프로그램 (P200A100044) 분야의 대학원 지원을 통해 교육부에 의해 지원되었다.
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
References
- Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15 (2), 118-124 (2012).
- Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
- Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
- Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49 (5), 579-581 (1987).
- Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (15), 5891-5896 (2008).
- Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. 생화학. 46 (48), 13677-13683 (2007).
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7 (8), 626-633 (2000).
- Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32 (1), 145-156 (2007).
- Kee, J. -. M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7 (1), 44-51 (2012).
- Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. 생화학. 33 (25), 7917-7924 (1994).
- Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276 (44), 41182-41190 (2001).
- Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162 (1), 198-210 (2015).
- Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (3), 331-337 (2015).
- Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7 (72), 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131 (3413), 1608-1609 (1960).
- Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31 (6), 371-374 (1980).
