조건부 재 프로그래밍을 이용하여 인간의 소아 식도 상피 세포의 확장 결함이나 부상을 치료 및 치료 심사 분석을위한 저수지 역할을하는자가 이식을 위해 식도 구조 엔지니어링에 이용 될 수있는 셀의 환자 별 인구와 수사관을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
조직 공학 및 질병 조사에 사용하기 위해 배양에서 환자 특이적 세포를 식별하고 확장하는 것은 매우 어려울 수 있습니다. 관심 세포 유형을 도출하기 위해 다양한 유형의 줄기 세포를 활용하는 것은 종종 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 매우 비효율적입니다. 또한 이 세포 소스를 사용하기 전에 원치 않는 세포 유형을 제거해야 하며, 이를 위해서는 프로세스의 또 다른 단계가 필요합니다. 식도 구조의 내강을 설계하거나 식도 질환 치료를 위한 치료 방법을 스크리닝하기에 충분한 식도 상피 세포를 얻기 위해서는 유전자 발현이나 표현형을 변경하지 않고 천연 식도 상피 세포를 확장해야 합니다. 식도 상피 조직의 조건부 재프로그래밍은 환자 특이적 식도 상피 세포를 확장하기 위한 유망한 접근 방식을 제공합니다. 또한, 이러한 세포는 분류하거나 정제할 필요가 없으며 조건부 재프로그래밍 배양에서 제거한 후 성숙한 상피 상태로 돌아갑니다. 이 기술은 많은 암 스크리닝 연구에서 설명되었으며 여러 계대에 걸쳐 이러한 세포를 무기한 확장할 수 있습니다. 식도 선별 검사를 수행할 수 있는 능력은 환자의 증상을 유발하는 유발 메커니즘을 식별하여 호산구성 식도염과 같은 소아 식도 질환의 치료에 혁명을 일으키는 데 도움이 될 것입니다. 선천적 결함, 질병 또는 식도 부상으로 고통받는 환자의 경우, 이 세포 공급원은 영향을 받은 부위를 복구하거나 대체하기 위해 이식용 합성 구조물을 파종하는 수단으로 사용될 수 있습니다.
서론
식도 조직 공학 및 호산 구성 식도염 (삼킴)는 지난 10 년간 많은 실험실에서 연구의 초점이되고있다. 이러한 식도 폐쇄증과 같은 선천성 결함, 1 먹을 수 없다는 선도 식도의 불완전 개발 결과 약 1 4,000에서 출산에 볼 수 있습니다. 호산구 식도염의 발생률과 유병률은 1993 년 질병 엔티티의 식별이 호산구 식도염의 빈도는 10 인 - 연간 / 100,000 0.7에서 변화와 유병률은 43 / 10 만 2 0.2에서 원거리 이후로 증가하고있다. 롱갭 식도 폐쇄증의 치료에 대한 새로운 매력적인 접근법 수술은 환자 자신의 세포를 이용하여 이식을위한 조직 구조를 생성하는 것으로 이루어진다. 합성 비계와 함께이 세포들은 면역 억제를 필요로하지 않는자가 구조를 생성합니다. 일부 그룹은 이미 우리를 조사하기 시작했다7 - 식도 조직 공학 (3)뿐만 아니라 고유의 식도 상피 세포의 사용과 같은 줄기 세포의 예는 점막 4를 다시 채울. 소아 환자의 식도에 존재하는 질병은 종종 진단이나 간섭없이 공부하기 어렵다. 또한, 사용 동물 모델 또는 시험 관내에서 정확한....
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프로토콜
동의가 소아 환자의 부모 / 보호자로부터 및 기관 검토위원회 (IRB # 13-094)에 따라 얻은 후 식도 생검을 얻었다.
1. 살균 악기 및 젤라틴 솔루션
- 오토 클레이브 겸자 면도날 및 오염을 방지하기 위해 조직을 처리하기 전에 위.
- 0.1 % 젤라틴 용액을 200 mL로, 젤라틴 0.2 g에 증류수 200 ㎖를 조합. 압력솥 멋진 사용하기 전에.
2. 코팅 조직 배양 플레이트
- 종래 셀 분리하는데 약 2 시간이, 조직 배양 접시 (100mm)를 커버하고, 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다 충분한 0.1 % 젤라틴을 추가한다.
참고 :이 접시도 미리 만들어 사용하기 전에 배양기에서 유지 될 수있다.
3. 해리에 대한 효소 솔루션을 만들기
- 약 세포 분리에 앞서 30 분, 밖으로 무게유리 병에 밀리그램 농도 당 단위를 기준으로 균형에 디스 파제의 10 대. 37 ° C의 물을 욕조에 10 ㎖ 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) 및 장소 15 ML 원뿔 튜브에 분말을 배치합니다.
4. 만들기 ....
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결과
환자로부터 생검 식도 상피 세포를 단리의 주요 단계의 요약은도 1에 요약 하였다. 상피 세포의 콜로니는 약 4-5일에 형성되고 섬유 아세포의 피더 세포 (그림 2A)에 의해 포위됩니다. 이러한 식민지가 확장됨에 따라 그들은 더 큰 식민지 (그림 2B)를 형성하기 위해 다른 식민지로 병합합니다. 문화가 70 % 합류하게되면, 그들은 (그림 2C)를 확장 할 필요가있다. 섬유 아세포 전에 상피 세포를 제거하기 판에서 제거되는 것을 보장하기 위해, 0.05 % 트립신 EDTA는 피더를 제거하기 위해 최대 2.5 분 동안 사용됩니다. 피더의 부재는 2D 그림과 유사하게 나타납니다. 자기편 상피 세포를 0.25 % 트립신 - EDTA와 트립신 새로운 조사 피더 세포 (그림 2E)에
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토론
환자로부터 생검 식도 상피 세포를 분리하고 확장하기 위해 가장 중요한 단계가있다 : 1) 적절히 최소 세포사와 생검 조직 해리; 2) 보장 ROCK 억제제마다 변화 매체에서 세포 배양 배지에 첨가되고; 3) 권장보다 더 피더 세포를 사용하지 마십시오 4) 깨끗한 무균 문화를 유지; 5) 합류에 도달하기 직전 통로 세포.
조건부 인해 프로그래밍 얻어 생검 표본에서 환자 - 관련 차이로는 성장 동역학, 표현형 여러 통로로 확장하는 능력의 차이를 예상하는 것이 합리적이다. 일반적으로, 4 식도 생검 세포 격리 각 환자로부터 얻을 수있다. 일단 해리, 우리는이 평균 통로 (3)에 의해 만 10 세포로 확장 일 0에서 약 300,000-600,000 세포를 그물. 상피 세포 라인에 대한 설명 조약돌 형태를 유사하게 나타납니다 형성 식민지의 형태 25 (그림 2). 문화에 세포의 샘플은 유동 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업을 지원해 준 Connecticut Children's Medical Center Strategic Research Funding에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| 돼지 껍질의 젤라틴 | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | ||
| 15 mL 원뿔형 튜브 | Denville Scientific | C1017-p | |
| 완전한 각질 세포 무혈청 매체 | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| 인슐린 솔루션 | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| 인간 표피 성장 인자 (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK 억제제 (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 중간 | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| 소 태아 혈청 | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% 트립신-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% 트립신-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100mm 접시 | 덴빌 Scientific | T1110-20 | |
| 150mm 접시 | Denville Scientific | T1115 | |
| 50mL 원뿔 | Denville Scientific | C1062-9 | |
| 인산염 완충 식염수 정제 | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL 피펫 | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL 피펫 | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL 피펫 | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" 파스퇴르 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 세포 | ATCC | CRL1658 |
참고문헌
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57
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재인쇄 및 허가
