La reprogramación condicional de células epiteliales del esófago Pediátrico Humano para el Uso en Ingeniería de Tejidos e Investigación de Enfermedades
Summary
Expansión de las células epiteliales del esófago pediátricos humanos que utilizan reprogramación condicional proporciona a los investigadores con una población específica del paciente de las células que puede ser utilizada para la ingeniería de las construcciones de esófago para la implantación autóloga para tratar defectos o lesiones y servir como depósito para ensayos de cribado de terapéuticas.
Abstract
Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.
Introduction
la ingeniería de tejidos del esófago y la esofagitis eosinofílica (EOE) han sido el foco de la investigación en muchos laboratorios en la última década. Los defectos congénitos, tales como la atresia esofágica, se observan en aproximadamente 1 de cada 4.000 nacidos vivos, lo que resulta en el desarrollo incompleto del esófago que lleva a la incapacidad para comer 1. La incidencia y prevalencia de la EE han ido en aumento desde que la identificación de la entidad de la enfermedad en 1993. La incidencia de la EE varió de 0,7 como 10 / 100.000 por persona-año y la prevalencia varió de 0,2 a la 43 / 100.000 2. Un nuevo abordaje quirúrgico atractivo para el tratamiento de larga distancia atresia esofágica consiste en la generación de construcciones de tejido para su implantación utilizando las propias células del paciente. Estas células, en relación con el andamio sintético generarán una construcción autólogo que no requiere la supresión inmune. Algunos grupos ya han comenzado a investigar los EE.UU.e de las células madre como para ingeniería de tejido de esófago 3, así como el uso de células epiteliales del esófago nativos para repoblar la mucosa 4-7. Las enfermedades que están presentes en el esófago de los pacientes pediátricos son a menudo difíciles de diagnosticar o estudiar sin necesidad de intervención. Por otra parte, la utilización de modelos animales o in vitro de líneas celulares inmortalizadas modelos para enfermedades pediátricas como la EE no abarcan la patogénesis de la enfermedad exacta o diferencias específicas de cada paciente 8. Por lo tanto, la capacidad de estudiar proceso de la enfermedad de un paciente in vitro con el fin de identificar los antígenos específicos de la enfermedad de activación, evaluar los mecanismos subyacentes e investigar los tratamientos con fármacos sería novedoso y proporcionar a los médicos con información que puede ayudar en el tratamiento del paciente.
Ha habido muchos tipos de células autólogas o específicos de los pacientes que se han propuesto para su uso en tissue ingeniería y el estudio de la patogénesis de la enfermedad humana. Sin embargo, algunos de estos tipos de células están limitados en su capacidad de generar suficientes células de un fenotipo específico a las semillas de un gran andamio o llevar a cabo un alto rendimiento en los estudios in vitro. El uso de células madre pluripotentes o multipotentes ha sido el tema de mucha discusión investigación, sin embargo, limitaciones y deficiencias para el uso de estas células han sido bien descritos 9. El uso de células madre embrionarias humanas es muy debatido y presenta muchos problemas éticos. Más importante, estas células forman teratomas, que son similares a un tumor, si no se diferencian de su estado pluripotente antes de la entrega de ellos en un huésped vivo 10. Además, el uso de células madre embrionarias no sería específica del paciente y podría provocar una respuesta alogénica y la necesidad de inmunosupresión 10. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) son células pluripotentes que puedense derivan de las propias células de un paciente. Las células somáticas, tales como células de la piel, pueden ser inducidos a un estado pluripotente usando una variedad de técnicas de integración y no de integración. Estas células sirven como fuentes de células específicos para cada paciente para ingeniería de tejidos o la investigación de la enfermedad. La integración de material genético no deseado en estas células es una preocupación muchos han descrito e incluso si las secuencias son completamente eliminados iPSCs parecen conservar una "memoria" epigenética hacia el tipo de célula de la que se derivaron 11. Estas células también formarán teratomas in vivo si no diferenciadas antes del trasplante 11. Muchos protocolos de diferenciación se han investigado centrándose en linajes epiteliales 12, 13, 14, sin embargo, es muy importante tener en cuenta que los tipos de células resultantes al final de la diferenciación no son homogéneos y oólo poseen una fracción del tipo celular de interés. Esto resulta en un rendimiento bajo y la necesidad de purificar el tipo celular deseado. Aunque iPSCs son una fuente celular específica del paciente potencial, el proceso para obtener un tipo de célula de interés, ya sea para la ingeniería de tejidos o la investigación de la enfermedad es muy ineficiente.
Células epiteliales humanas se han aislado con éxito de una variedad de ambos tejidos enfermos y no enfermos en el cuerpo humano, incluyendo: pulmón 15, pecho 16, el intestino delgado 17, colon 18, la vejiga 19 y el esófago 20. Es importante tener en cuenta que las células primarias humanas tienen un número finito de pasos en los que el fenotipo se mantiene 21, 22. Desafortunadamente, esto significa que el número de células necesarias para la investigación de la enfermedad o para la siembra de un andamio de ingenieríapara la implantación no puede ser alcanzado. Por lo tanto, se necesitan nuevas técnicas para expandir las células del paciente mientras que todavía mantiene un fenotipo epitelial. Reprogramación condicional de células epiteliales normales y cancerosas utilizan células alimentadoras y inhibidor de la roca fue descrito en 2012 por Liu et al. 2 3. Esta técnica se utilizó para expandir las células epiteliales cancerosas obtenidas de biopsias de cáncer de próstata y de mama utilizando células alimentadoras irradiadas, inhibidores de la ROCA y medianas reprogramación condicional. El objetivo era generar suficientes células para ensayos in vitro tales como la detección de drogas. Esta técnica es capaz de expandir las células epiteliales de forma indefinida por "reprogramación" estas células a un vástago o estado progenitor similar, que es altamente proliferativa. Se ha demostrado que estas células son no tumorigénicos y no poseen la capacidad de formar teratomas 23, 24. Además, no seanomalías cromosómicas o manipulaciones genéticas estaban presentes después de pases estas células en cultivo usando esta técnica 23, 24. Lo más importante, estas células sólo son capaces de diferenciarse en el tipo de célula nativa de interés. Por lo tanto, esta técnica ofrece una gran reserva de células epiteliales de pacientes específicos para la investigación de la enfermedad o la ingeniería de tejidos sin la necesidad de la inmortalización.
La obtención de tejido epitelial de un órgano específico con el fin de estudiar los procesos de enfermedad es a menudo limitado y no siempre es posible debido a riesgo del paciente. Para aquellos pacientes que sufren de enfermedad esofágica o defectos, la recuperación de biopsia endoscópica es un método mínimamente invasivo para la obtención de tejido epitelial que puede ser disociado y condicionalmente reprogramado para proporcionar una fuente de células indefinido que es específico de la mucosa del esófago de ese paciente. Esto permite entonces para estudios in vitrode las células epiteliales para evaluar los procesos de enfermedad y la pantalla para terapéuticos potenciales. Un proceso de la enfermedad que podría beneficiarse en gran medida de este enfoque es esofagitis eosinofílica, que ha sido descrito como una enfermedad alérgica del esófago 8. Las pruebas de alergia, así como enfoques terapéuticos podrían ser evaluados in vitro usando las propias células epiteliales del paciente y estos datos pueden ser pasados al médico tratante para desarrollar planes de tratamiento individualizados. La técnica de reprogramación condicional en conjunción con la obtención de biopsias endoscópicas de pacientes pediátricos ofrece la posibilidad de expandir las células epiteliales del esófago normales indefinidamente de cualquier paciente. Por tanto, esta fuente de células podría ser asociado junto con el andamio natural o sintética para proporcionar una opción quirúrgica específica del paciente en busca de defectos, enfermedad o trauma. Tener un número indefinido de células podría ayudar a diseñar construcciones esofágicas que poseen un completo vuelven a sembrarlumen con las células epiteliales del esófago con el fin de ayudar a facilitar la regeneración de los tipos de células restantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más importantes con el fin de aislar y expandir las células epiteliales del esófago de biopsias de pacientes son: 1) disociar adecuadamente tejido de biopsia con la muerte celular mínima; 2) garantizar inhibidor de la roca es añadido al medio de cultivo celular en cada cambio de medio; 3) No use más células alimentadoras que los recomendados; 4) mantener un cultivo aséptico limpio; y 5) las células de paso justo antes de llegar a la confluencia.
Debido a las diferencias re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge Connecticut Children’s Medical Center Strategic Research Funding for supporting this work.
Materials
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15ml Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50ml Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
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