ティッシュ・エンジニアリングと疾病調査に使用するための小児のヒト食道上皮細胞の条件付き再プログラミング
Summary
条件付き再プログラミングを利用した人の小児食道上皮細胞の拡大は、欠陥やけがを治療し、治療的スクリーニングアッセイのためのリザーバとして機能する自家移植のために食道の構築物を設計するために利用することができる細胞の患者特有の人口を持つ研究者を提供します。
Abstract
Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.
Introduction
食道組織工学と好酸球性食道炎（EoEのは）過去10年間で多くの研究室での研究の焦点となっています。このような食道閉鎖症などの先天性の欠陥は、1を食べることができないことにつながる食道の不完全な開発につながる約1 4000で出生、に見られます。 EoEのの発生率と罹患率は1993年に病気のエンティティの識別EoEのの発生率は、人年あたり0.7から10 / 100,000に変化し、有病率は0.2〜43 /10万2の範囲であって以来、増加しています。長いギャップ食道閉鎖症を治療する新しい魅力的外科的アプローチは、患者自身の細胞を用いた移植のための組織構築物を生成することにあります。合成足場に関連してこれらの細胞は、免疫抑制を必要としない自己の構築物を生成します。いくつかのグループには、すでに私たちを調査し始めています7 –食道組織工学3だけでなく、ネイティブの食道上皮細胞の使用のための幹細胞様細胞のeは粘膜4を再入力します。小児患者の食道内に存在している疾患は、多くの場合、診断または介入なしで勉強するのは難しいです。また、利用する動物モデルまたはin vitroで、正確な疾患の病因または患者特異的な差異8を包含しないEoEのような小児疾患の細胞株モデルを不死化。したがって、抗原を誘発する特定の疾患を同定する基礎となるメカニズムを評価し、薬物治療を調べるために、インビトロで患者の疾患の過程を研究する能力は、新規であると患者の治療を助けることができる情報を臨床医に提供します。
TISSUにおける使用のために提案されてきた多くの自己または患者特異的細胞型がありました電子工学およびヒト疾患の病因を研究。しかしながら、これらの細胞型のいくつかは、大きな足場をシードまたはインビトロ試験で高いスループットを実行するために特定の表現型の十分な細胞を生成する能力が限られています。多能性又は多分化能性幹細胞の使用は、多くの研究の議論の主題となっているが、これらの細胞を使用するための制限および欠点がよく9に記載されています。ヒト胚性幹細胞の使用は非常に議論し、多くの倫理的な問題を提示されています。最も重要なことは、これらの細胞は、それらが前の生きたホスト10にそれらを提供すること、それらの多能性状態と区別されていない場合、腫瘍に類似している奇形腫を形成します。また、胚性幹細胞の使用は、患者特異的ではないであろうと、同種異系応答および免疫抑制10の必要性を誘発する可能性があります。人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、そのでき多能性細胞であります患者自身の細胞から誘導することができます。このような皮膚細胞などの体細胞は、統合および非統合の様々な技術を用いて、多能性状態に誘導することができます。次いで、これらの細胞を組織工学または疾患の研究のための患者特異的細胞源として働きます。これらの細胞内への不必要な遺伝物質の統合は、多くが記載されているとの配列が完全に除去性IPSCは、彼らが11を誘導された細胞型に向けてエピジェネティックな「記憶」を節約するために表示されている場合でも問題です。移植11の前に分化していない場合、これらの細胞は、 生体内で奇形腫を形成します。多くの分化プロトコルは、しかし、分化の終了時に得られた細胞型が均一とOではないことに注意することは非常に重要であり、上皮系統12、13、14に着目し研究されていますNLY目的の細胞型の割合を有します。このことは、低い収率および所望の細胞型を精製する必要が生じます。 iPS細胞は、潜在的な患者特有の細胞源であるが、組織工学又は疾患の調査のどちらかのために目的の細胞型を得るためのプロセスは非常に非効率的です。
肺15、胸16、小腸17、結腸18、膀胱19および食道20：ヒト上皮細胞が正常に含む人体の両方の罹患および非罹患種々の組織から単離されています。ヒト初代細胞の表現型は、21、22を維持する通路の有限数があることを留意することが重要です。残念ながら、このことは、疾患の研究のために又は操作足場に播種するために必要なセルの数移植のために達成されない場合があります。したがって、新たな技術が依然として上皮表現型を維持しながら、患者の細胞を拡大するために必要とされます。フィーダー細胞及びROCK阻害剤を用いた、正常および癌性上皮細胞の再プログラミング条件は、Liu らにより2012年に記載されました。 2 3。この技術は、照射されたフィーダー細胞を、ROCK阻害剤および条件付き再プログラミング媒体を使用して、前立腺癌および乳癌の生検から得られた癌性上皮細胞を拡大するために利用されました。目標は、このような薬物スクリーニングなどのin vitroアッセイのための十分な細胞を生成することでした。この技術は、幹細胞または高度に増殖性である前駆体のような状態へのこれらの細胞の「再プログラミング」によって無期限に上皮細胞を拡大することが可能です。これらの細胞は、非腫瘍形成性であり、奇形23、24を形成する能力を有さないことが実証されています。また、無染色体異常または遺伝子操作は、この技術23,24を用いて培養中のこれらの細胞を継代した後に存在しました。最も重要なことは、これらの細胞は、目的のネイティブな細胞型に分化することができます。したがって、この技術は不死化を必要とせずに、疾患の調査や組織工学のための患者特有の上皮細胞の大規模な貯水池を提供しています。
疾患過程を研究するために、特定の器官の上皮組織を入手することは、患者のリスクを常に頻繁に制限されないことが可能です。食道疾患や欠陥を患っている患者では、内視鏡生検の取得は解離し、条件付きでその患者の食道の粘膜に特異的である不定細胞源を提供するために再プログラムすることができ上皮組織を得るための低侵襲性アプローチです。これは、その後、in vitro試験を可能にします上皮細胞の潜在的な治療のための疾患過程と画面を評価しました。非常にこのアプローチから利益を得ることができる1つの疾患過程は、食道8のアレルギー性疾患として記載された好酸球性食道炎です。アレルギー試験ならびに治療的アプローチは、患者自身の上皮細胞を用いてin vitroで評価することができ、このデータは、個別の治療計画を開発するために、治療する医師に渡すことができます。小児患者からの内視鏡生検を得ることに関連して、条件付き再プログラミングの技術は、任意の患者から無期限に正常食道上皮細胞を拡張する機能を提供しています。この細胞源は、したがって、欠陥、病気や外傷のための患者固有外科的選択肢を提供するために、天然または合成の足場と一緒に組んですることができました。不定細胞数を持つことは、完全に再播種持って食道のコンストラクトを設計に役立つだろう残りの細胞タイプの再生を促進するのを助けるために、食道の上皮細胞でルーメン。
Protocol
Representative Results
Discussion
患者の生検から食道上皮細胞を分離し、拡大するために最も重要な手順は次のとおりです。1）適切最小限の細胞死と生検組織を解離させます。 2）ROCK阻害剤は、すべての培地交換で細胞培養培地に添加されていることを確認します。 3）推奨よりも多くのフィーダー細胞を使用しないでください。 4）クリーンな無菌の文化を維持します。 5）コンフルエンスに到達する直前に継代細胞。
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge Connecticut Children’s Medical Center Strategic Research Funding for supporting this work.
Materials
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15ml Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50ml Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
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