MitoCeption: overbrengen geïsoleerde menselijke MSC Mitochondriën aan glioblastoma Stamcellen
Summary
Hier, wordt een protocol (MitoCeption) voorgelegd aan mitochondriën geïsoleerd uit menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) over te dragen, glioblastoma stamcellen (GSC), met als doel het bestuderen van hun biologische effecten op het metabolisme en de functies SGR. Een soortgelijk protocol kan worden aangepast aan mitochondriën dragen tussen andere celtypen.
Abstract
Mitochondriën spelen een centrale rol voor de celstofwisseling, de productie van energie en de controle van apoptose. Onvoldoende mitochondriale functie is verantwoordelijk voor de zeer uiteenlopende ziekten gevonden, variërend van neurologische aandoeningen aan kanker. Interessant mitochondria is onlangs aangetoond dat het vermogen weer worden overgedragen tussen celtypen, zoals uit menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) om kankercellen in coculture omstandigheden met metabole en functionele consequenties voor de mitochondriën ontvangende cellen, verdere verbetering van de huidige belangstelling de biologische eigenschappen van deze organellen.
De effecten van de MSC overgedragen mitochondriën in de doelcellen van primair belang voor de biologische resultaat van deze cel-cel interacties begrijpen. De MitoCeption protocol beschreven voor de overdracht van de mitochondria vooraf geïsoleerd uit de donorcellen aan de doelcellen met behulp MSC mitochondriaen glioblastoma stamcellen (SGR) als modelsysteem. Dit protocol is eerder gebruikt om mitochondriën geïsoleerd overbrengen van MSCs tot MDA-MB-231 kankercellen beoefenaar. Deze mitochondria transfer protocol wordt hier aangepast voor GSCs dat de specifieke bijzonderheid van groeien als neurosferen in vitro te presenteren. De overdracht van de geïsoleerde mitochondria kan worden gevolgd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en confocale beeldvorming met behulp mitochondria vitale kleurstoffen. Het gebruik van mitochondria donor en doelcellen met verschillende haplotypen (SNPs) maakt ook detectie van het overgedragen mitochondriën gebaseerd op de concentratie van de cirkelvormige mitochondriaal DNA (mtDNA) in de doelcellen. Nadat het protocol is gevalideerd met deze criteria, kunnen de cellen die de overgedragen mitochondria verder geanalyseerd om het effect van de exogene mitochondriën biologische eigenschappen zoals celmetabolisme, plasticiteit, proliferatie en respons op behandeling vast te stellen.
Introduction
Mitochondriën zijn organellen in eukaryote cellen waar ze een centrale rol spelen bij voedselopname en energie en metabolietproductie. Deze organellen bevatten circulair mitochondriaal DNA (mtDNA), 16,6 kb lang, dat eiwitten van het elektron transport keten complexen, tRNA en rRNA 1 codeert. De functionaliteit van deze organellen is essentieel voor celhomeostase en verscheidene ziekten zijn geassocieerd met dysfunctie mitochondria 1, 2, 3. De status mitochondria is bijvoorbeeld in verband gebracht met ontsteking, chronische infecties en kanker, in het laatste geval met gevolgen voor metastase en therapieresistentie 4, 5, 6, 7.
Mitochondriën tonen de opmerkelijke capaciteit van krijgen overgedragen tussen "donor" en "target" cellen. Dit leidt tot veranderingen in de energetische metabolisme van de doelcellen en in andere functionele modificaties zoals weefselherstel en resistentie tegen chemotherapeutische middelen, zoals onlangs aangetoond door verschillende laboratoria 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. De menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's) tonen het vermogen om mitochondriën te dragen aan een grote verscheidenheid aan doelcellen, zoals cardiomyocyten, endotheelcellen, pulmonaire alveolaire epitheelcellen, renale tubulaire cellen en kankercellen, leidend tot modificaties van de functionele eigenschappen van deze cellen 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
Mitochondriën uitwisseling wordt nu als een veel gebruikt mechanisme dat een aantal verschillende celtypen te communiceren met elkaar en hun biologische eigenschappen wijzigen. Deze mitochondria uitwisseling kan plaatsvinden door middel van tunneling nanobuisjes (TNT) formatie, waarbij connexine 43-bevattende gap junctions 8 of M-Sec / TNFaip2 en de exocyst complex 19. Als alternatief werd de mitochondriën overdracht ook getoond te worden gemedieerd door arrestin-domein bevattend eiwit 1 gemedieerde microvesicles (ARMMs) 20. Interessant is dat de effectiviteit van de mitochondria overschrijving verbonden met de expressiesnelheid van de Rho GTPase 1 MIRO1 21, een belangrijke factor voor het verklaren van de verschillen in mitochondria overdracht efficacies tussen iPSC-MSCs en volwassen BM-MSC 22.
Desondanks schat aan gegevens betreffende cel-cel mitochondriën uitwisseling relatief weinig bekend over het metabolisme en biologische uitkomst van deze mitochondria overdracht. Daarom rechtvaardigt het opzetten van de juiste tools om de biologische effecten van deze overdracht volledig te kunnen beoordelen. Door de jaren heen een aantal technische benaderingen overbrengen mitochondria van donor naar acceptor cellen zijn voorgesteld. Dit omvat directe injectie van mitochondriën in oöcyten 23, 24, 25, celfusie te 26 genereren transmitochondrial cybriden, 27 en, meer recentelijk, de overdracht van geïsoleerde mitochondria gebruik fotothermische nanoblades 28.
Wij en anderen eerder aangetoond het vermogen van geïsoleerde mitochondria worden geïnternaliseerd door levende cellen, zoals waargenomen zowel in vitro als in vivo 29, 30, 31, via mechanismen voorgesteld macropinocytose 32 betrekken. Verder hebben we een methode ontwikkeld, genaamd MitoCeption om kwantitatief geïsoleerde mitochondria (van MSCs) aan doelcellen, zoals bijvoorbeeld de (lid) MDA-MB-231 borstkanker cellijn 31. Dit protocol werd aangepast hier voor de overdracht van geïsoleerde menselijke MSC mitochondriën glioblastoma stamcellen (GSC).
Glioblastoom zijn agressieve kwaadaardige tumoren van de hersenen die snel resistent zijn tegen behandeling te worden, vooral als gevolg van glioblastoma stamcellen (GSC) die aanwezig zijn in de tumor 33. Deze GSCs groeien als neurosferen in vitro en het genereren van tumoren in xenograft modellen. Kankercellen binnen glioblastoma hebben devermogen om cel-cel verbindingen te maken, zoals recent aangetoond voor astrocyten hersentumor cellen die interconnect via uitgebreid microbuizen, waardoor mitochondriën (als calcium en celkernen) kan migreren, wat resulteert in radiotherapie-resistente astrocytoom netwerken 34. Glioblastoma een groot aantal verschillende cellen rekruteren in de tumor micro-omgeving, zoals MSC's 35, 36. We toonden aan dat MSCs cel-cel verbindingen met GSC in coculture kunnen maken en hun mitochondria (gegevens niet getoond), die naar verwachting SGR functionele eigenschappen te wijzigen overdragen. Dit protocol beschrijft hoe de MitoCeption techniek kan worden gebruikt om mitochondriën geïsoleerd voren brengen van menselijke MSCs, menselijke GSCs met de bepaling van de functionele biologische uitkomst. De multipotente en zeer tumorigene GB4 GSC lijn 37 werd gebruikt in deze studie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Steeds studies tonen aan dat cellen mitochondriën kunnen uitwisselen en dat deze mitochondriën ingrijpende effecten op de doelcel metabolisme en functie. Daarom is het essentieel om de juiste spullen voor mitochondria kwantitatief uit de donorcellen deze doelcellen goed bestuderen van de biologische effecten mogelijk te maken.
De hier beschreven protocol was oorspronkelijk uitgewerkt mitochondriën geïsoleerd uit menselijke mesenchymale stamcellen dragen aan de hechtende kanker cellijn MD…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Andrea Parmeggiani (L2C en DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), evenals leden van het laboratorium voor nuttige discussies, Christophe Duperray voor hulp bij de FACS-analyse, het Montpellier RIO imaging faciliteit (MRI) voor het leveren van de adequate omgeving voor FACS en confocale microscopie. BNM werd ondersteund door een afgestudeerde beurs van de Labex Numev (conventie ANR-10-LabX-20). AB werd ondersteund door een undergraduate beurs van de Universiteit van Warschau en de Europese Unie (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV is een staf wetenschapper van het Nationaal Centrum voor Wetenschappelijk Onderzoek (CNRS).
Materials
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 |
| N-2 Supplement (100X) | Fisher Scientific | 11520536 |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50X) | Fisher Scientific | 11500446 |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 |
| poly Heme | Sigma | P3932 |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F |
| DMEM/F-12 without glutamine, | Fisher Scientific | 11540566 |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 |
| Glucose | Sigma | G7021 |
| Insuline | Sigma | I 1882 |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| CaCl2 | MERCK | 2382 |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 |
| Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).
- Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
- Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).
- LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
- Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
- Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
- Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94 (2013).
- Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
- Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
- Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
- Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
- Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
- Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
- Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
- Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472 (2015).
- Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
- Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
- Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
- Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
- Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
- Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
- Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
- Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
- Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073 (2015).
- Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057 (2016).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
- Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
- Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
- Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881 (2013).
