MitoCeption: Glioblastoma Kök Hücreleri için İzole İnsan MSC kondriyayı aktarma
Summary
Burada, bir protokol (MitoCeption) GSC metabolizması ve fonksiyonları üzerine biyolojik etkilerini inceleyerek amacı ile glioblastoma kök hücreler (GSC) için, insan mezenkimal kök hücrelerin (MSC) izole mitokondri, transfer sunulmaktadır. Benzer bir protokol için diğer hücre tipleri arasında mitokondri aktarmak için adapte edilebilir.
Abstract
Mitokondri hücre metabolizması, enerji üretimi ve apoptozis kontrolü için merkezi bir rol oynar. Yetersiz mitokondriyal fonksiyonu nörolojik patolojilerden kansere kadar çok çeşitli hastalıklardan sorumlu olduğu bulunmuştur. İlginç bir şekilde, mitokondri en son kapasitesini göstermek için gösterilmiştir, soz konusu ilgi artırılması, mitokondri alıcı hücrelerin metabolik ve işlevsel sonuçları ile Coculture koşullarında kanser hücrelerine insan mezenkimal kök hücreler (MSC) ile ilgili özellikle, hücre tipleri arasında aktarılacak bu organellerin biyolojik özellikleri.
hedef hücrelerde transfer MSC mitokondri etkilerinin değerlendirilmesi, hücre-hücre etkileşimleri biyolojik sonucu anlamak için temel önem taşır. Burada açıklanan MitoCeption protokolü MSC mitokondri kullanılarak hedef hücrelere donör hücrelerinden daha önce izole edilmiş mitokondri aktarılmasını sağlarbir model sistem olarak glioblastoma kök hücreleri (GSC). Bu protokol daha önce MDA-MB-231, kanser hücrelerini yapışık için, MSC ile ilgili mitokondri, izole aktarmak için kullanılmaktadır. Bu mitokondri aktarım protokolü in vitro neurospheres olarak büyüyen özel tikelliği sunmak GSC 'lerin burada uyarlanmıştır. İzole mitokondri transferi mitokondri vital boya kullanılarak floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) konfokal görüntüleme ile izlenebilir. tat haplotypes (SNP) ile mitokondri donör ve hedef hücrelerin kullanımı, aynı zamanda, hedef hücrelerde Dairesel mitokondriyal DNA (mtDNA) konsantrasyonuna göre transfer mitokondri saptanmasını sağlar. Protokol Bu kriterlerdeki doğrulandıktan sonra, transfer mitokondri barındıran hücreler, bundan başka, hücre metabolizması, plastisite, proliferasyon ve tedaviye yanıt olarak biyolojik özellikler üzerinde dışsal mitokondri etkilerini belirlemek için analiz edilebilir.
Introduction
Mitokondri da besin alımı hem de enerji ve metabolit üretimi önemli bir rol oynar ökariyotik hücrelerde bulunan organellerdir. Bu organellerin dairesel mitokondrial DNA elektron taşıma zinciri kompleksleri, tRNAs ve rRNA 1 proteinlerini kodlayan 16.6 kb uzunluğunda (mtDNA), içerirler. Bu organellerin işlevselliği hücre homeostazı ve çeşitli patolojiler mitokondri disfonksiyonu 1, 2, 3 ile ilişkilendirilmiştir için önemlidir. Mitokondri durum mesela Therapy 4, 5, 6, 7, metastaz ve direnç sonuçları, bu ikinci durumda, enflamasyon, enfeksiyon hastalıkları ve kanser ile bağlantılı olmuştur.
Mitokondri olağanüstü kapasitesi görüntüler "Donör" ve "hedef" hücreler arasında transfer alıyorum. Son zamanlarda, 15 farklı laboratuarlar 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ile gösterildiği gibi bu, örneğin doku onarımı ve kemoterapötik ajanlara karşı direnç gibi diğer işlevsel değişiklikler yanı sıra hedef hücrelerin enerji metabolizmasında değişikliklere yol açar 16. Insan mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) bu hücrelerin fonksiyonel özellikleri modifikasyonlara yol kardiyomiyositler, endotel hücreleri, pulmoner alveolar epitel hücreleri, renal tübüler hücreler ve kanser hücreleri dahil olmak üzere hedef hücrelerin bir çok çeşitli mitokondri transfer Bu yetiyi sergileyen 8> 9, 10, 12, 17, 18.
Mitokondri değişimi artık farklı hücre tipleri bir dizi birbirleriyle iletişim ve biyolojik özelliklerini değiştirmek için izin veren bir yaygın olarak kullanılan bir mekanizma olarak görünür. Bu mitokondri değişimi 19 karmaşık konneksin 43 içeren gap junction 8 veya M-Sec / TNFaip2 ve exocyst içeren, tünel nanotüpler (TNT) oluşumu yoluyla oluşabilir. Seçenek olarak ise, mitokondri transferi de etki alanı içeren protein 1 dolayımlı microvesicles (ARMMs) 20 arrestin aracılık ettiği gösterilmiştir. İlginçtir ki, mitokondri transferi etkinliği Rho GTPaz 1 ifadesi oranı MIRO1 21, iPSC- arasında mitokondri transferi etkinliklerinin farklılıkları açıklamak için bir anahtar faktör bağlantılı olduğunuMKH ve yetişkin BM-MKH 22.
Hücre-hücre mitokondri alışverişine ilişkin verilerin bu zenginliği rağmen, nispeten daha az bu mitokondri transferi metabolik ve biyolojik sonuçları hakkında bilinmektedir. Bu nedenle, tam tam bu transferin biyolojik etkilerini değerlendirmek için uygun araçlar kurma garanti. Yıllar boyunca, çeşitli teknik yaklaşımları alıcı hücrelere donörden mitokondri aktarmak için önerilmiştir. Bu 27 transmitochondrial sibrid 26 oluşturmak için oosit 23, 24, 25, hücre füzyonunun olarak mitokondri doğrudan enjeksiyon içerir ve daha yakın zamanda, fototermal kullanarak izole mitokondri transferi 28 nanoblades.
Biz ve diğerleri, daha önce izole edilmiş mitochond kapasitesini göstermiştirin vitro ve in vivo olarak görüldüğü gibi, RIA, canlı hücreler tarafından edilmesi Mekanizmalarla 29, 30, 31, 32, makropinositoz içerdiği öne. Biz daha nicel olarak (yapışık) ile örneklendiği gibi, hedef hücrelere, MDA-MB-231 göğüs kanseri hücre çizgisi 31 (MSC ile ilgili) izole mitokondri aktarmak için, MitoCeption adlı bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokol glioblastoma kök hücreleri izole insan MSC mitokondri transferi (GSC 'lerin) burada uyarlanmıştır.
Glioblastoma hızla ağırlıklı olarak tümör 33 içinde mevcut glioblastoma kök hücrelerinin (GSC) için, tedaviye dirençli hale beynin agresif kötü huylu tümörlerdir. Bu GSC 'lerin in vitro neurospheres olarak büyümeye ve ksenogreft modellerinde tümörleri oluşturur. glioblastoma içinde Kanser hücreleri varRadyoterapi dayanıklı astrositoma ağları 34 ortaya çıkartılmıştır mikrotüplerde aracılığıyla birbirine olan mitokondri (aynı zamanda kalsiyum ve hücre çekirdekleri) üzerinden geçiş için astrositik beyin tümörü hücreleri için, son olarak kapasite, hücreden hücreye bağlantı yapmak için. Glioblastoma MKH 35, 36 de dahil olmak üzere, tümör mikro içinde birçok farklı hücre işe. Biz MKH kokültürü GSC 'lerin hücre-hücre bağlantıları yapmak ve GSC fonksiyonel özelliklerini değiştirmek için beklenen onların mitokondri (veriler gösterilmemiştir), aktarabilirsiniz gösterdi. Mevcut protokol MitoCeption tekniği işlevsel biyolojik sonuçlarını belirlemek amacıyla insan GSC 'lerin için, insan MSC gelen mitokondri, izole önceden aktarmak için nasıl kullanılabileceği anlatılmaktadır. Multipotent ve son derece tümörijenik GB4 GSC hattı 37 bu çalışmada kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
çalışmaların sayısı giderek artıyor hücreleri mitokondri alışverişi olduğunu ve bu mitokondri hedef hücre metabolizması ve fonksiyonları üzerinde derin etkilere sahip olduğunu göstermektedir. Nedenle, miktar olarak biyolojik etkilerini doğru bir çalışma sağlamak için, bu hedef hücreler verici hücrelerinden mitokondri aktarmak için araçları ana esastır.
Burada açıklanan protokol başlangıçta yapışık kanser hücre hattı MDA-MB-231 33</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yararlı tartışmalar için laboratuvar üyeleri yanı sıra Andrea Parmeggiani (L2C ve DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier) teşekkür ederim, Christophe Duperray sağlamak için FACS analizi, Montpellier RIO görüntüleme tesisi (MRG) ile yardım için FACS ve konfokal mikroskopi için yeterli ortam. BNM LABEX Numev (kongre ANR-10-LabX-20) mezunu burs ile desteklenmiştir. AB Varşova ve Avrupa Birliği Üniversitesi'nden lisans bursu tarafından desteklenmiştir (n POKL.04.01.02-00-221 / 12 °). MLV bilimsel araştırmalar için Ulusal Merkezi (CNRS) bir personel bilim adamıdır.
Materials
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 |
| N-2 Supplement (100X) | Fisher Scientific | 11520536 |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50X) | Fisher Scientific | 11500446 |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 |
| poly Heme | Sigma | P3932 |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F |
| DMEM/F-12 without glutamine, | Fisher Scientific | 11540566 |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 |
| Glucose | Sigma | G7021 |
| Insuline | Sigma | I 1882 |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| CaCl2 | MERCK | 2382 |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 |
| Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).
- Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
- Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).
- LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
- Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
- Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
- Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94 (2013).
- Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
- Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
- Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
- Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
- Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
- Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
- Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
- Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472 (2015).
- Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
- Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
- Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
- Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
- Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
- Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
- Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
- Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
- Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073 (2015).
- Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057 (2016).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
- Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
- Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
- Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881 (2013).
