MitoCeption：神経膠芽腫幹細胞に単離されたヒトMSCミトコンドリアの転送
Summary
ここでは、プロトコル（MitoCeption）はGSCの代謝および機能に対するそれらの生物学的効果を研究する目的で、神経膠芽腫幹細胞（GSC）を、ヒト間葉系幹細胞（MSC）から単離されたミトコンドリアを転送するために提示されています。同様のプロトコルは、他の細胞型との間のミトコンドリアを転送するように適合させることができます。
Abstract
ミトコンドリアは、細胞代謝、エネルギー産生およびアポトーシスの制御に中心的な役割を果たす。不十分なミトコンドリア機能は、神経病変から癌に至るまで、非常に多様な疾患の原因が分かっています。興味深いことに、ミトコンドリアは最近容量を表示することが示されており、さらに現在の関心を高め、ミトコンドリアのレシピエント細胞を代謝および機能的結果と、共培養条件下で癌細胞にヒト間葉系幹細胞（MSC）からのとりわけ、細胞タイプとの間で転送されますこれらの細胞小器官の生物学的特性のために。
標的細胞における転写MSCミトコンドリアの効果を評価することは、細胞 – 細胞相互作用の生物学的結果を理解するために最も重要です。ここで説明MitoCeptionプロトコルは、MSCのミトコンドリアを用いて、標的細胞へのドナー細胞から予め単離されたミトコンドリアの移動を可能にしますモデル系としておよび神経膠芽腫幹細胞（GSC）。このプロトコルは、以前にMDA-MB-231癌細胞を接着するために、MSCをから単離されたミトコンドリアを転送するために使用されてきました。このミトコンドリア転送プロトコルは、in vitroでのニューロスフェアとして成長の具体的な特殊性を提示GSCsのためにここに適合されています。単離ミトコンドリアの転写は、ミトコンドリア生体染色色素を用いた蛍光活性化細胞選別（FACS）および共焦点イメージングによって追跡することができます。異なるハプロタイプ（のSNP）を有するミトコンドリアのドナーおよび標的細胞の使用は、標的細胞におけるそれらの円形のミトコンドリアDNA（ミトコンドリアDNA）の濃度に基づいて、転送ミトコンドリアの検出を可能にします。プロトコルは、これらの条件で検証された後、転送ミトコンドリアを有する細胞はさらに、細胞代謝、可塑性、増殖、および治療に対する応答としての生物学的特性に外因性のミトコンドリアの効果を決定するために分析することができます。
Introduction
ミトコンドリアは、彼らが栄養摂取ならびにエネルギーおよび代謝物の生産において中心的な役割を果たし、真核細胞に見られる細胞小器官です。これらの細胞小器官は、電子輸送鎖複合体、tRNA及びrRNAの1のタンパク質をコードして16.6キロバイトの長円形のミトコンドリアDNA（mtDNAのを）、含まれています。これらの細胞小器官の機能は、ミトコンドリア機能不全1、2、3で細胞ホメオスタシスおよびいくつかの病態のための重要な関連しているされています。ミトコンドリアの状態は、例えば、治療4、5、6、7への転移及び抵抗性の結果この後者の場合には、炎症、感染症および癌に関連しています。
ミトコンドリアはの驚くべき能力を表示します 「ドナー」と「ターゲット」セル間転勤。最近になって、15の異なる研究室8、9、10、11、12、13、14によって示されるように、これは、例えば、組織修復および化学療法剤に対する耐性のような他の機能の改変と同様に、標的細胞のエネルギー代謝の変化をもたらします、16。ヒト間葉系幹細胞（MSC）は、これらの細胞の機能的特性の改変をもたらす、心筋細胞、内皮細胞、肺の肺胞上皮細胞、腎尿細管細胞と癌細胞を含む標的細胞の多種多様なミトコンドリアを転送するこの能力を示します8、> 9、10、12、17、18。
ミトコンドリア交換は、現在の異なる細胞型の数が互いに通信し、それらの生物学的特性を変更することができ、広く使用されるメカニズムとして現れます。このミトコンドリア交換は19複雑なコネキシン43を含むギャップジャンクション8またはM-秒/ TNFaip2とエクソシストを含む、トンネルナノチューブ（TNT）の形成を介して発生する可能性があります。代替的に、ミトコンドリアの転送は、ドメイン含有タンパク質1媒介性微小胞（ARMMs）20アレスチンによって媒介されることが示されました。興味深いことに、ミトコンドリアの転送の有効性は、RhoのGTPアーゼ1 MIRO1 21、iPSC-間のミトコンドリア転送効能の違いを説明するための重要な因子の発現率にリンクされましたMSCおよび成人BM-MSCの22。
細胞と細胞のミトコンドリア交換に関するデータのこの富のにもかかわらず、比較的少ないが、このミトコンドリア転送の代謝性および生物学的結果について知られています。したがって、それは完全に完全にこの転送の生物学的効果を評価するための適切なツールをセットアップ保証します。長年にわたり、受容細胞へのドナーからミトコンドリアを転送するためのいくつかの技術的なアプローチが提案されています。これは27、transmitochondrialサイブリッド26を生成するために、卵母細胞23、24、25、細胞融合にミトコンドリアの直接注入を含みます そして、最近では、光熱nanoblades 28を用いて、単離されたミトコンドリアの転送。
我々と他の人は以前に分離されたmitochondの能力を実証しましたインビトロおよびインビボの両方で観察されたようにRIAは、生細胞によって内在化されます メカニズムを通して29、30、31は 、マクロピノサイトーシス32が関与することを提案しました。我々はさらに、定量的（付着）で例示されるように、標的細胞にMDA-MB-231乳癌細胞株31（MSCS）から単離されたミトコンドリアを転送するために、MitoCeptionと呼ばれる方法を開発しました。このプロトコルは、神経膠芽腫幹細胞（GSCs）の単離されたヒトMSCのミトコンドリアの転送のためにここに適合させました。
神経膠芽腫は急速に主に起因する腫瘍33内に存在する神経膠芽腫幹細胞（GSC）に、治療に耐性となる脳の積極的な悪性腫瘍です。これらのGSCsは、in vitroでのニューロスフェアとして成長し、異種移植モデルにおいて腫瘍を発生させます。神経膠芽腫内癌細胞は持っています放射線治療抵抗性星細胞腫のネットワーク34で、その結果、移行することができるミトコンドリア（ならびにカルシウムおよび細胞核）まで延長マイクロチューブを介して、その相互接続アストロサイトの脳腫瘍細胞のために最近示されるように、細胞から細胞への接続を行うための能力。神経膠芽腫は、MSC 35、36を含む、腫瘍微小環境内の多くの異なる細胞を動員することができます。我々は、GSC機能的特性を変更すると予想される（データは示さず）MSCは共培養でGSCsと細胞間接続を行い、それらのミトコンドリアを転送することができることを示しました。現在のプロトコルはMitoCeption技術はそれらの機能の生物学的結果を決定する目的でヒトGSCsに、ヒトMSCからのミトコンドリア、孤立事前を転送するために使用する方法について説明します。多能性の高い腫瘍形成GB4 GSC線37は、この研究において使用しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
研究の増加は、細胞がミトコンドリアを交換することができること、およびこれらのミトコンドリアは、標的細胞の代謝および機能に重大な影響を有することを示しています。したがって、定量的に、それらの生物学的効果の正確な研究を可能にするために、これらの標的細胞へのドナー細胞からのミトコンドリアを転送するためのツールを習得することが不可欠です。
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は提供するために、FACS分析のヘルプはモンペリエRIOイメージング施設（MRI）をアンドレア・パルメジャーニ（L2CとDIMNP、モンペリエ）、ブノワCharlotの（IES、モンペリエ）と同様に有用な議論のための研究室のメンバー、クリストフDuperrayに感謝しますFACSおよび共焦点顕微鏡のための適切な環境を提供します。 BNMはLabEx Numev（大会ANR-10-LABX-20）から大学院の交わりによってサポートされていました。 ABは、ワルシャワと欧州連合（EU）の大学（nはPOKL.04.01.02-00-221 / 12°）から学部交わりによってサポートされていました。 MLVは、科学研究のためのナショナルセンター（CNRS）からスタッフの科学者です。
Materials
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 |
| N-2 Supplement (100X) | Fisher Scientific | 11520536 |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50X) | Fisher Scientific | 11500446 |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 |
| poly Heme | Sigma | P3932 |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F |
| DMEM/F-12 without glutamine, | Fisher Scientific | 11540566 |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 |
| Glucose | Sigma | G7021 |
| Insuline | Sigma | I 1882 |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| CaCl2 | MERCK | 2382 |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 |
| Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
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