방법 논문

MitoCeption는 : 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아 전송

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DOI:

10.3791/55245

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2017년 2월 22일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine and Biotherapy (IRMB), INSERM U1183, Montpellier University, 2Institute of Neurosciences of Montpellier (INM), INSERM U1051, Montpellier University

이 논문에서

요약

여기에, 프로토콜 (MitoCeption)는 GSC 대사와 기능에 대한 생물학적 효과를 연구 목적으로, 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC)로, 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 격리 된 미토콘드리아를 전송하기 위해 제공됩니다. 유사한 프로토콜이 다른 세포 유형 간 미토콘드리아를 전송하도록 구성 될 수있다.

초록

미토콘드리아는 세포 대사, 에너지 생산 및 세포 사멸의 제어를위한 중심적인 역할을한다. 부적절한 미토콘드리아 기능은 신경 학적 병변에서 암에 이르기까지 매우 다양한 질병에 대한 책임이 발견되었다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 최근 용량을 표시하도록 도시 된 상기 현재 관심을 향상 미토콘드리아받는 세포 대사 및 기능적 결과와 공 배양 조건에서 암 세포에 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 특히 세포 유형 사이에서 전송 될 이러한 세포 소기관의 생물학적 특성에 대한.

표적 세포에서 전사 MSC 미토콘드리아의 효과를 평가하는 것은 예컨대 세포 - 세포 상호 작용의 생물학적 결과를 이해하기 위해 가장 중요하다. 여기에 설명 MitoCeption 프로토콜 MSC 미토콘드리아를 이용하여 표적 세포를 도너 세포로부터 미리 격리 미토콘드리아의 전송을 허용모델 시스템으로서 교 모세포종 및 줄기 세포 (GSC). 이 프로토콜은 이전에 MDA-MB-231 유방암 세포를 접착하는 중간 엽 줄기 세포에서 미토콘드리아 격리를 전송하는 데 사용되었다. 이것은 미토콘드리아 전송 프로토콜은 체외로 neurosphere를 성장시키는 특정 특이성을 제시 GSC를 여기하도록 구성된다. 격리 된 미토콘드리아의 전달은 미토콘드리아에게 중요한 염료를 사용하여 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 공 초점 이미징 다음에 할 수 있습니다. 별개의 일배 체형 (SNP가)와 미토콘드리아 공여체 및 목표 세포의 사용은 또한 표적 세포에서의 원형 미토콘드리아 DNA (미토콘드리아)의 농도에 기초하여 상기 전송 된 미토콘드리아의 검출을 허용한다. 프로토콜이 이러한 기준을 검증 한 후에, 전사 된 미토콘드리아 형질 세포를 상기와 같은 세포 대사, 소성, 증식 및 치료에 대한 응답으로서 생물학적 특성에 외인성 미토콘드리아의 효과를 결정하기 위해 분석 될 수있다.

서론

미토콘드리아는 영양소 흡수뿐만 아니라 에너지 대사 산물 생산의 중심적인 역할을 진핵 세포에서 발견되는 세포 내 소기관이다. 이 세포 소기관은 원형 미토콘드리아 DNA 전자 수송 체인 단지,의 tRNA 및 rRNAs 1의 단백질을 인코딩 16.6 KB 긴 (미토콘드리아 DNA)를 포함합니다. 이러한 소기관의 기능은 세포 항상성 여러 병리는 미토콘드리아 장애 1, 2, 3과 연관되어 매우 중요하다. 미토콘드리아 상태는 예를 들어 치료를 4, 5, 6, 7 전이 저항에 대한 영향이 후자의 경우에, 염증, 감염증, 암에 연결되어있다.

미토콘드리아는의 놀라운 능력을 표시 "기증자"과 "대상"세포 사이에 전송하기. 최근에, 15 개의 실험실 <....

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프로토콜

1 일

중간 엽 줄기 세포의 1 라벨링 (MSC) 미토콘드리아 (선택 사항)

  1. 1 일에 문화에 4 × 10 5 엽 줄기 세포를 갖도록 이틀 미토콘드리아 준비하기 전에, 10 ml의 αMEM / FBS 10 %에서 100 밀리미터 배양 접시에서 인간 중간 엽 줄기 세포를 시드.
  2. PBS (4 ml)로 중간 엽 줄기 세포를 씻어 4 ml의 αMEM / FBS 1 %를 추가 (37 ° C로 데워진).
  3. 37 ° C 배양기에서 30 분 동안 세포를 미토콘드리아 중요한 염료의 필요한 양을 추가하고 품어.
  4. , 미토콘드리아 염료 용액을 제거 데워진 4 ㎖ (37 ° C) αMEM / FBS 1 %로 두 번 세포를 씻어 내고 다시 4 ml의 αMEM / FBS 10 %를 추가합니다. 37 ° C에서 세포를 품어.
  5. 2 시간 후, 다른 시간 30 분 후 배지 (αMEM 10 ㎖ / FBS 10 %)을 변경하고.

1 일

아교 모세포종 줄기 세포 (GSC) 2. 라벨 (선택 사항, 토론 섹션 참조)

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결과

간엽 줄기 세포 (MSC) 및 MitoCeption하여 타겟 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC) 그들의 전송에서 미토콘드리아의 분리를 개설 절차의 단계는도 1에 도시된다. GSC를 자신의 줄기 세포 특성을 유지하기 neurosphere를로 성장 암 줄기 세포이다. 이 프로토콜의 경우, GSC를 미토콘드리아가 높은 전송 효율을 허용 미토콘드리아 (단계 3)의 전송 전에 단일 세포로 두 시간을 시딩 (FACS 데이터도 3b 참조). 제 5 조 (3 일) 후,이 세포를 neurosphere를을 (그림 1) 형성으로 다시 관찰된다.

GB4 GSC를의 이미징, 형광 표지 된 MSC의 미토콘드리아와 MitoCeption 후 72 시간은, 공 초점 이미지에서 얻은 직교 뷰에 의해 입.......

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토론

연구의 증가는 세포가 미토콘드리아를 교환 할 수 있고 이러한 미토콘드리아 표적 세포 대사와 기능에 심각한 영향을 보여준다. 따라서, 양적으로 생물학적 효과의 정확한 연구 있도록이 표적 세포에 공여 세포에서 미토콘드리아를 전송하는 툴을 습득하는 것이 필수적이다.

여기에 설명 된 프로토콜은 원래 점착성 암 세포주 MDA-MB-231 33 인간 중간 엽 줄기 세포로부터 분리 된 미토콘드리아를 전송할 아웃 처리 하였다. 여기에 도시 된 바와 같이,이 체외 neurosphere를 암으로 성장 줄기 세포에 대해 적응 될 수있다. 미토콘드리아 전송 MSC 미토콘드리아가 GSC의 neurosphere를 첨가 할 때 발생할 수 없지만, 본 프로토콜에 기재된 바와 같이, 그것은, 하나의 셀에 GSC를보다 효율적이었다. 이 프로토콜은 또한, 행의 필요성, T 세포와 같은 다른 비 - 부착 세포에 외삽 될 수있다MitoCeption 단계를.......

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공개 사항

INSERM (연구소 국립 드 라 상테 등 드 라 공들인 MEDICALE),있는 CJ와 ML.V. 제휴의 MitoCeption 기술 (EP14306154.7)에 특허 출원을 제기했다.

감사의 글

우리는 도움이 토론에 대한 실험실의 구성원뿐만 아니라 안드레아 Parmeggiani (L2C 및 DIMNP, 몽펠리에), 벤와 샬럿 (IES, 몽펠리에를) 감사합니다, 크리스토프 Duperray를 제공하기위한 FACS 분석은 몽펠리에 RIO 영상 설비 (MRI)에 대한 도움말 FACS와 공 초점 현미경에 적합한 환경을 제공합니다. BNM은 LABEX Numev (규칙은 ANR-10 LabX에-20)에서 대학원 친교에 의해 지원되었다. AB 바르샤바과 유럽 연합 (EU)의 대학에서 학사 교제에 의해 지원되었다 (N POKL.04.01.02-00-221 / 12 °). MLV는 과학 연구를위한 국립 센터 (CNRS)에서 직원 과학자입니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
조직용 미토콘드리아 분리 키트 피셔 사이언티픽 
N-2 보충제 (100x)Fisher Scientific11520536
B-27 보충제 W/O VIT A (50x)Fisher Scientific 
HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+  시그마H4385
폴리 헴 시그마 P3932
aMEM w/o 글루타민OzymeBE12-169F
DMEM/F-12 글루타민 없음Fisher Scientific 
L-글루타민 인비트로젠 25030-024 
포도당 시그마 G7021
인슐린 시그마 나는 1882년 
인간  bFGF R& D 시스템233-FB-025
인간 EGF 페프로텍 AF-100-15 
헤파린시그마H3149 
CaCl2MERCK2382
트립신 억제제시그마 T9003
DNase I시그마 
트립신 0.25% / EDTA 1  mM인비트로젠 
트립신Gibco 15090-046
프로테아제 억제제 EDTA 프리시그마4693159001
시프로플록사신 시그마17850-5G-F
펑진 인비보젠ant-fn-1
Fungizone Thermofisher15290018
GentamycinEuromedexEU0410
MitoTracker Green FM분자 프로브M7514
MitoTracker Red CMXRos분자 프로브  M7512
MitoTracker 딥 레드 FM분자 프로브  M22426 
CellTracker Green CMFDA분자 프로브C7025
CellTracker Blue CMF2HC분자 프로브C12881
RIPASanta Cruzsc-24948
FluoroDish 멸균 배양 접시세계 정밀 기기FD35-100
HemacytometerFisher Scientific267110
FACS 튜브Beckman Coulter2,523,749
FACS 장치Gallios   3L 10C
LC 패스트 스타트 DNA 마스터 플러스 로슈3515885001
1057966311500446115405661010415900125200056

참고문헌

  1. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  3. Chandel, N. S.

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