やっぱりアオモンイトトンボ精子における活性酸素種の細胞内局在の評価
Summary
このプロトコルは、やっぱりアオモンイトトンボ精子核の ROS は、ミトコンドリアのライブ ミトコンドリア染色 DAPI の敏感な螢光色素 DCFH-DA を使用して内 H2O2の局在を検出するための詳細な方法についてを記述します。可視化、それぞれ。プロトコルは、新鮮なまたは解凍精子と 2 h 内で実行する設計されています。
Abstract
酸化ストレスは、精子の質を減少させる重要な要因の 1 つです。どんな種の重要度が高いは、精子の活性酸素種 (ROS) を検出するための効率的なプロトコルの開発が、これらのメソッドは、使用頻度の低いと硬骨魚も少ない。凍結保存は遺伝子銀行を含め、さまざまな目的のため養殖の便利なテクニックを年間を通じて精子可用性を保証します。凍結/融解手順や原因になる活性酸素産生精子細胞に損傷を与えます。考えると、将来の損害が活性酸素産生の過剰の原因、ローカリゼーション、ここによって精子の H2O2を検出し、共焦点顕微鏡による細胞内局在化を評価する詳細な方法について提供しています。この目的のため 3 螢 (2 ‘, 7 ‘ Dichlorodihydrofluorescein セルロースジ アセテート (DCFH DA)、ライブ ミトコンドリア染色と 4 ‘, 6-Diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI)) の組み合わせは、2 H2O の共局在の評価に使用されます。精子核やミトコンドリアソレア senegalesis精子サンプル。
Introduction
活性酸素種の生産は、精子の質とリンクされている最近1。ミトコンドリアの活性酸素産生には、通常の生理学的なプロセスを考えることができる、さまざまなレベルで精子の損傷の明確な原因は活性酸素産生の過剰による酸化ストレス。人間、酸化ストレスは、男性不妊症、運動性や受精2を受けるための能力を変更することに関連付けられています。哺乳類で、凍結精子サンプルの DNA の完全性の変化は H2O23の合成にも関連しています。
凍結保存は養殖で銀行の遺伝子のための一般的な手法です。この技術はやっぱりアオモンイトトンボなど生殖器の問題を持つ種で特に重要です。市場でこの貴重な種は、求愛の不足のため飼育下で生まれた個体の生殖機能障害を示しています。この事実は、精子の凍結保存を人工受精精子の可用性を持っている必要になります。しかし、凍結は、酸化ストレスと抗酸化サプリメントの有益な効果が報告されての精子4有害なことができるのソース可能性があります。ミトコンドリアをターゲットとした抗酸化作用による活性酸素抑制は黄色いナマズ5精子凍結保存用伝え有益であった。
したがって、精子サンプル中の ROS のレベルは、これらの分子は、精子の生存と不妊治療8の欠点として認識されているので、特に凍結6、7の後知ることが重要。さらに、細胞内 ROS の分布を調査、潜在的な損傷のレベルを推測する重要な可能性があります。例として通常、精子機能と互換性のある、ミトコンドリアにおける活性酸素の低レベルを想定できるが、核内活性酸素の高レベルは、精子の DNA 損傷の指標かもしれない。H2O2は、ミトコンドリアから解放されることができる、小さなおよび電荷レス分子9だから核を浸透最も関連性の高い活性酸素の 1 つです。ジクロルフルオレッセン ジアセテート (DCFH DA) 具体的には緑色の蛍光を発光細胞内の過酸化水素を明らかにできます。この記事は、やっぱりアオモンイトトンボ精子共焦点顕微鏡を用いた H2O2細胞内の局在を検出するための詳しいプロトコルが表示されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
精子の運動性と機能キー細胞小器官であるミトコンドリアが知られています。これらの細胞小器官は、同時に直接活性酸素産生に関与しています。興味深いことに、適切な精子機能1活性酸素の制御のレベルが必要です。肯定的な哺乳類11不妊と酸化ストレスとの関係が示されているが、過剰なレベルに影響を与える精子品質12。正または?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AQUAGAMETE FA 1205 コスト行動に感謝いたします。この作品は AGL201568330 C2 1 R プロジェクト (MINECO/フェダー) によって財政上支えられます。デイヴィッド g. Valcarce 資金が供給された軍事政権・ デ ・ カスティーリャ ・ イ ・ レオン (EDU1084/2012 年) とフォンド社会 Europeo。著者は、博士アナ リアサ Stolt 海ファーム社、博士パウリノ ・ デ ・ ラパス、博士・ イグナシオ ・ マルティネス モンテロとホセ ・ ラモン ・ Guiérrez を認めます。我々 はビデオ撮影にポーラ フェルナンデス Colado をありがとうも。
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
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