Reaktif oksijen türleri Solea Senegalensis sperm hücreleri, hücre içi konumunu değerlendirilmesi
Summary
Bu iletişim kuralı H2O2 Yerelleştirme Solea senegalensis sperm hücreleri hassas fluorochrome DCFH-DA ROS, mitokondri için canlı mitokondri leke ve DAPI için çekirdek için kullanma içinde algılamak için detaylı bir metodoloji açıklar görselleştirme, anılan sıraya göre. Protokol taze ya da çözdürülen sperm hücreleri ile 2 saat içinde yapılması için tasarlanmıştır.
Abstract
Oksidatif stres sperm kalitesini azalan en önemli faktörlerden biridir. Reaktif oksijen türleri (ROS) sperm hücreleri içinde algılamak için etkin iletişim kuralları geliştirme herhangi bir tür yüksek öneme sahip olduğunu, ancak bu yöntemler sık kullanılmayan ve teleost içinde daha az. Dondurma gen bankacılık dahil olmak üzere farklı amaçlar için yararlı bir yöntem su ürünleri içinde ve sperm kullanılabilirlik yıl boyunca garantili. Yordamlar donma/çözülme ROS üretimin neden ve sperm hücrelerine de zarar. Göz önüne alındığında bu potansiyel zarar ROS üretim aşırı onların yerelleştirme bağlı olarak sperm H2O2 algılamak ve hücre içi onun yerelleştirme tarafından confocal mikroskobu değerlendirmek için detaylı bir metodoloji neden sağlanır. Bu amaçla, 3 fluorochromes (2 ‘, 7 ‘-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), bir canlı mitokondri leke ve 4 ‘, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)) bir arada ortak Yerelleştirme2 H2O değerlendirmek için kullanılır sperm hücreleri çekirdek veya mitokondri Solea senegalesis sperm örnekleri ile.
Introduction
Reaktif oksijen türleri üretim sperm kalitesi ile bağlantılı son zamanlarda1. Ne kadar ROS üretim mitokondri içinde normal bir fizyolojik süreç olarak, ROS üretim aşırı Oksidatif Stresin farklı düzeylerde sperm hücreleri hasara açık bir nedenidir. İnsanlarda, oksidatif stres hareketliliği ve yetenek capacitation2geçmesi için değiştirme erkek infertilitesi ile ilişkilidir; Memelilerde, DNA bütünlük içinde donmuş sperm örnekleri değişikliği de H2O23sentezi için ilgili olmuştur.
Dondurma yetiştiricilik bankacılık gen için ortak bir tekniktir. Bu teknoloji özellikle türlerin Solea senegalensisgibi üreme sorunları ile önemlidir. Piyasada değerli bu türün üreme disfonksiyon bireylerde tutsak Kur eksikliği nedeniyle tarihi gösterir. Bu gerçeği sperm dondurma sperm durumu Yapay döllenme için gerekli kılar. Ancak, dondurma gibi çalışmalar antioksidan takviyesi faydalı etkisini bildirdin bu spermlerin4 için zararlı olabilir oksidatif stres kaynağı olacaktır. ROS inhibisyonu yoluyla mitokondrial hedefli antioksidan bildirildi sperm dondurma sarı yayın balığı5için faydalıdır.
Bu nedenle, ROS seviyelerinde sperm örnekleri bu moleküller sperm hayatta kalma ve üreme8için bir dezavantaj olarak kabul edilmiş, özellikle dondurma6,7 sonra bilmek önemlidir. Ayrıca, ROS dağıtım hücre içinde eğitim potansiyel hasar düzeyi anlaması çok önemli olabilir. Örnek olarak, ROS seviyesinin düşük mitokondri içinde normal ve uyumlu sperm fonksiyonu ile kabul edilebilir ama ROS yüksek düzeyde çekirdek içinde Sperm DNA hasarı belirtileri olabilir. H2O2 mitokondri yayımlanan olabilir ve bir küçük ve ücret daha az molekül9olduğu için çekirdek nüfuz en alakalı ROS biridir. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) özellikle hücre içi peroksit yeşil Floresans yayan ortaya çıkarabilir. Bu makalede, H2O2 hücre içi Yerelleştirme Solea senegalensis sperm confocal mikroskobu kullanılarak tespit için detaylı bir protokol sunulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
İyi mitokondri sperm motilitesi ve fonksiyon için anahtar organelleri vardır bilinmektedir. Bu organelleri aynı anda doğrudan ROS üretim söz konusu. İlginçtir, ROS kontrollü düzeyde uygun sperm fonksiyonu1için ihtiyaç vardır. Doğurganlık ve oksidatif stres arasında olumlu ilişkiler memeliler11 ‘ de gösterilen ama sperm kalitesi12aşırı düzeyleri etkiler. Doğru pozitif veya negatif etkisi belirleyici olabilir bir önemli bir fak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AQUAGAMETE SK 1205 maliyet eylem teşekkür ediyoruz. Bu eser mali AGL201568330-C2-1-R project (MINECO/FEDER) tarafından desteklenmiştir. David G. Valcarce cunta de tarafından finanse edilen Castilla y Leon (EDU1084/2012) ve Fondo sosyal Europeo. Yazar Dr. Ana Riaza ve Stolt deniz çiftlik S.A., Dr Paulino de Paz, Dr Ignacio Martínez Montero ve José Ramón Guiérrez kabul edersiniz. Biz de videografisi için Paula Fernández Colado teşekkür ederim.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O’Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function–in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
