Summary

הערכה של המיקום תאיים של מינים חמצן תגובתי ב- Solea Senegalensis Spermatozoa

Published: March 11, 2018
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה מפורט לגילוי H2O2 לוקליזציה בתוך Solea senegalensis spermatozoa באמצעות fluorochrome רגיש DCFH-DA ROS, כתם המיטוכונדריה בשידור חי עבור המיטוכונדריה, דאפי עבור גרעינים ויזואליזציה, בהתאמה. הפרוטוקול נועד להתבצע בתוך 2 h עם spermatozoa טריים או המופשרים.

Abstract

סטרס חמצוני הוא אחד הגורמים החשובים בהפחתת באיכות הזרע. פיתוח פרוטוקולי יעיל לגילוי מינים חמצן תגובתי (ROS) ב- spermatozoa היא בעלת חשיבות גבוהה בכל מין, אך שיטות אלה הן נדירות אפילו פחות teleost. הקפאה קריוגנית היא טכניקה שימושית בחקלאות ימית למטרות שונות, לרבות בנקאות ג’ין והבטיחה את הזרע זמינות לאורך כל השנה. הקפאה \ הפשרה הליכים יכול לגרום ROS הייצור, נזק לתאי הזרע. בהתחשב פוטנציאליים נזק זה עודף של ROS הפקה עלול לגרום ב spermatozoa תלוי לוקליזציה שלהם, הנה מתודולוגיה מפורט כדי לזהות2O H2 וכן להעריך שלה לוקליזציה תאיים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מסופק. למטרה זו, שילוב של 3 fluorochromes (2 ′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), כתם המיטוכונדריה בשידור חי ו- 4 ′, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי)) משמשים להערכת ההתאמה שיתוף של H2O2 עם spermatozoa גרעינים או המיטוכונדריה דגימות זרע Solea senegalesis .

Introduction

ההפקה של מינים חמצן תגובתי נקשרה עם איכות זרע לאחרונה1. למרות ROS הייצור בתוך המיטוכונדריה יכול להיחשב תהליך פיזיולוגי נורמלי, סטרס חמצוני על-ידי עודף הייצור ROS הוא סיבה ברורה של פגיעה ב spermatozoa ברמות שונות. בבני אדם, סטרס חמצוני מזוהה עם בעיות פוריות הגבר, שינוי תנועתיות ואת היכולת לעבור capacitation2; ביונקים, שינוי של שלמות הדנ א דגימות זרע קפוא גם קשורה סינתזה של H-2O-23.

הקפאה קריוגנית היא טכניקה נפוצה עבור ג’ין בנקאות, חקלאות ימית. טכנולוגיה זו חשוב במיוחד במינים עם בעיות הרבייה כגון Solea senegalensis. מין זה יקר בשוק מראה תפקוד הרבייה אצל אנשים נולדו בשבי עקב מחסור של חיזור. עובדה זו הופכת את הזרע הקפאה קריוגנית חייב להיות זמינות הזרע להפריה מלאכותית. עם זאת, הקפאה קריוגנית יכול להיות מקור של סטרס חמצוני זה יכול להיות מזיקה spermatozoa4 כמו מחקרים דיווחו על השפעה מיטיבה של תוספי נוגדי חמצון. ROS עיכוב באמצעות נוגדי חמצון מיטוכונדריאלי במיקוד היה מועיל הדיווחים על הקפאה קריוגנית זרע שפמנון צהוב5.

לכן, הרמות של ROS דגימות זרע חשובים לדעת, במיוחד לאחר הקפאה קריוגנית6,7 כי מולקולות אלה הוכרו חיסרון זרע הישרדות, פוריות8. יתר על כן, לומד את ההפצה של ROS בתוך התא יכול להיות מכריע להסיק שרמת נזק פוטנציאלי. לדוגמה, רמות נמוכות של ROS בתוך המיטוכונדריה יכול להניח נורמלי ולא תואם עם פונקציית זרע, אך רמות גבוהות של ROS בתוך הגרעין יכול להיות סממנים של נזק לדנ א spermatozoa. H2O2 הוא אחד האבחון הרלוונטיים ביותר יכול להשתחרר מן המיטוכונדריה, לחדור לגרעין כי הוא מולקולה קטנה, תשלום-פחות9. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) באופן ספציפי יכול לחשוף מי חמצן תאיים פולטות קרינה פלואורסצנטית ירוק. במאמר זה, מוצג עבור מזהה H2O2 לוקליזציה תאיים Solea senegalensis הזרע באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פרוטוקול מפורט.

Protocol

הערה: דגירה Fluorochrome וניתוח קונאפוקלית ייקח לפחות 2-3 h עבור פקד, מדגם שטופלו. חישוב זמן זה אינו כולל עיבוד נתונים. חומרים הדרושים ניתן למצוא את הטבלה של חומרים. פרוטוקול זה ניתן ליישם טריים או cryopreserved spermatozoa. Solea senegalensis הוא מין דג שמשריץ במים קרים, עבודה תמיד בתנאים קרים (4-7 ° C). ראה <…

Representative Results

מיקרוסקופיה קונפוקלית היא שיטה אידיאלית להערכה ROS תאיים זרע teleost. השילוב של שלוש fluorochromes (דאפי, הכתם המיטוכונדריה, DCFH-DA) שהוצגו במחקר זה (איור 1) מספק הרבה מידע שימושי, זה יכול להיות מיושם במחקר בסיסי ויש יישומים לשיפור תהליכי בשימוש חקלאות מים תעשייתי צמחים,…

Discussion

זה ידוע כי המיטוכונדריה הם organelles מפתח עבור זרע תנועתיות ותפקוד. Organelles אלה מעורבים במקביל ישירות בייצור ROS. מעניין, רמות מבוקרת של ROS נדרשים עבור זרע תקין פונקציה1. יחסים חיוביים בין פוריות סטרס חמצוני הוכחו יונקים11 אך רמות מוגזמות להשפיע על איכות הזרע12</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים AQUAGAMETE פא 1205 עלות פעולה. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי פרויקט AGL201568330-C2-1-R (MINECO/פדר). דוד ג Valcarce מומן על ידי דה חונטה ולאון (EDU1084 2012) ו Fondo Europeo חברתית. מחברים מכיר ד ר אנה Riaza, האנרגטי לים חווה דרום אמריקה, ד ר פאולין דה פז, ד ר איגנסיו מרטינס מונטרו, חוסה רמון Guiérrez. אנו מודים גם פאולה פרננדז Colado עבור צילום וידאו.

Materials

2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)  Sigma-Aldrich D6883
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)  Sigma-Aldrich D9542
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 
Confocal Microscopy Zeiss LSM800
Cover slips Thermo Fisher Scientific 12-541B
DMSO, Analytical Grade Sigma-Aldrich W387520
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P9541
Methanol, Analytical Grade Sigma-Aldrich 34860
MitoTrackerDeep Red  Thermo Fisher Scientific M22426
Microcentrifuge (refrigerated) Thermo Fisher Scientific 75002441
NaCl Sigma-Aldrich S7653 
Neubauerchamber Sigma-Aldrich BR717810
Slides Thermo Fisher Scientific 10143562BEF

References

  1. Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
  2. Morielli, T., O’Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
  3. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
  4. Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
  5. Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
  6. Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
  7. Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
  8. Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
  9. Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function–in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
  10. Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
  11. Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
  12. Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).

Play Video

Cite This Article
Valcarce, D. G., Robles, V. Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa. J. Vis. Exp. (133), e55323, doi:10.3791/55323 (2018).

View Video