Bewertung der intrazellulären Lage von reaktiven Sauerstoffspezies in Solea Senegalensis Spermatozoa
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Erkennung von H2O2 Lokalisierung innerhalb Solea Senegalensis Spermien mit einem sensiblen Fluorochrom RLKV-DA für ROS, ein Leben Mitochondrien Fleck für Mitochondrien und DAPI für Kerne Visualisierung, beziehungsweise. Das Protokoll soll innerhalb von 2 h mit frischen oder aufgetauten Spermien durchgeführt werden.
Abstract
Oxidativer Stress ist einer der wichtigsten Faktoren in abnehmender Qualität der Spermien. Entwicklung von effizienten Protokolle zur Erkennung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Spermien ist von großer Bedeutung in irgendeiner Sorte, aber diese Methoden sind selten genutzte und noch weniger in teleost. Kryokonservierung ist eine nützliche Technik in der Aquakultur für verschiedene Zwecke, einschließlich gen Banking und garantierte Verfügbarkeit der Spermien im Laufe des Jahres. Einfrieren/Auftauen Verfahren könnte dazu führen, dass ROS-Produktion und schädigen die Spermien. Bedenkt, dass die potenziellen Schäden kann ein Übermaß an ROS-Produktion in Spermien je nach ihrer Lokalisation, hier eine detaillierte Methode, H2O2 erkennen und bewerten die intrazelluläre Lokalisation durch konfokale Mikroskopie führen steht zur Verfügung. Zu diesem Zweck eine Kombination von 3 Fluorochromes (2, 7-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat (RLKV-DA), ein live Mitochondrien Fleck und 4 ‘, 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)) werden verwendet, um die Co Lokalisierung von H2O 2bewerten mit Samenzellen Kerne oder Mitochondrien in Solea Senegalesis Spermaproben.
Introduction
Reaktive Sauerstoff-Spezies-Produktion mit Spermienqualität verknüpft wurde vor kurzem1. ROS-Produktion in den Mitochondrien einen normalen physiologischen Prozess betrachtet werden kann, zwar oxidativer Stress durch ein Übermaß an ROS-Produktion eine klare Ursache des Schadens in Spermien auf verschiedenen Ebenen. Beim Menschen ist oxidativer Stress zugeordnet männliche Unfruchtbarkeit, Motilität und die Fähigkeit zur Rechtsfähigkeit2unterziehen zu verändern; bei Säugetieren ist Veränderung der DNA-Integrität in Tiefgefriersperma Proben auch zur Synthese von H2O23verbunden.
Kryokonservierung ist ein gängiges Verfahren für gen-banking in der Aquakultur. Diese Technologie ist besonders wichtig bei Arten mit reproduktiven Problemen wie Solea Senegalensis. Dieses wertvollen Arten auf dem Markt zeigt reproduktiven Dysfunktion bei Personen, die in Gefangenschaft aufgrund mangelnder Balz geboren. Diese Tatsache macht die Kryokonservierung von Spermien Spermien Verfügbarkeit für künstliche Befruchtung erforderlich. Jedoch könnte die Kryokonservierung eine Quelle von oxidativem Stress, die schädlich für Spermien4 sein könnte, wie Studien eine positive Wirkung von antioxidativen Supplementierung berichtet haben. ROS-Hemmung durch mitochondriale gezielte antioxidative war angeblich vorteilhaft für die Kryokonservierung von Spermien in gelbe Wels5.
Daher sind die Konzentrationen von ROS in Spermaproben wichtig zu wissen, vor allem nach Kryokonservierung6,7 , weil diese Moleküle als ein Nachteil für das Überleben der Spermien und Fruchtbarkeit8erkannt worden sind. Darüber hinaus könnte lernen die Verteilung von ROS innerhalb der Zelle entscheidend für die Höhe des potenziellen Schadens ableiten. Als Beispiel könnte niedrigen Niveau von ROS in den Mitochondrien können davon ausgegangen werden, normal und mit Spermienfunktion kompatibel, aber hohe Konzentrationen von ROS im Zellkern Indikatoren der Spermien-DNA-Schäden. H2O2 ist eines der wichtigsten ROS, die von den Mitochondrien freigesetzt werden könnten und den Kern zu durchdringen, denn es ist eine kleine und weniger Ladung-Molekül-9. Dichlorofluoresceins Diacetat (RLKV-DA) kann insbesondere intrazelluläre Peroxid emittierenden grünen Fluoreszenz zeigen. In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Erfassung von H2O2 intrazelluläre Lokalisation in Solea Senegalensis Spermien mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie vorgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist bekannt, dass Mitochondrien wichtigen Organellen für die Beweglichkeit der Spermien und Funktion sind. Diese Organellen sind gleichzeitig direkt an ROS-Produktion beteiligt. Interessanterweise sind kontrollierte ROS für richtige Sperma Funktion1benötigt. Positive Beziehungen zwischen Fruchtbarkeit und oxidativen Stress sind Säugetiere11 erwiesen, aber übermäßigen Niveaus beeinflussen Spermien Qualität12. Ein entscheidender Faktor, die …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Diese Arbeit wurde von AGL201568330-C2-1-R-Projekt (MINECO/FEDER) finanziell unterstützt. David G. Valcarce wurde finanziert durch die Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) und Fondo soziale Europeo. Autoren anerkennen Dr. Ana Riaza und Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero und José Ramón Guiérrez. Wir danken auch Paula Fernández Colado für Videografie.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
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