在斑马鱼胚胎人乳腺癌细胞的侵袭行为
Summary
在这里，我们将介绍使用两个不同的注射部位， 即卵周隙和居维叶管道，调查侵入行为，并分别评估人类乳腺癌细胞的血管内和外渗潜力，异种移植模型斑马鱼。
Abstract
在许多情况下，癌症病人不要原发性肿瘤的死亡，而是转移的原因。尽管众多的啮齿动物模型可用于体内研究癌症转移，需要其它有效的，可靠的，低成本的模型来快速访问的（EPI）的遗传变化或药理学化合物的潜在影响。因此，我们说明和解释采用注入斑马鱼胚胎，以支持这一目标的人类乳腺癌细胞异种移植模型的可行性。在显微镜下，荧光蛋白或化学标记的人乳腺癌细胞移植到转基因斑马鱼胚胎，TG（FLI：EGFP），在受精后48个小时的卵周隙或居维叶（DOC）的导管。不久之后，癌细胞侵袭，传播和转移在活鱼体内的时空处理在荧光显微镜下观察。使用不同的注射部位， 即模型，每ivitelline空间或文件是彼此互补，这反映了早期（血管内步骤）和晚期事件的多步转移级联的（外渗工序）。此外，瘤周和瘤内血管生成可与注入卵周隙被观察到。整个实验时间不超过8天。这两种模式相结合的细胞标记，微移植和荧光成像技术，使癌转移的快速评估响应于遗传学和药理学操作。
Introduction
在临床上明显的癌转移包括一系列被称为“转移级联”复杂和多步事件。级联已经被广泛审查，并可以分割成连续的步骤：局部浸润，血管内，传播，逮捕，外渗，和殖民1，2。更好地了解癌症转移的发病机理和潜在的治疗策略体内的发展需要癌细胞扩散的强大的主机型号。啮齿动物模型已经非常成熟和被广泛用于评估转移3，但是这些方法效率低和道德的限制和昂贵的最前沿模型，以确定一个特定的操作是否会影响转移表型。需要其他高效，可靠，低成本的模式，以快速访问（EPI）的遗传变化或pharmacolog的潜在影响的iCal化合物。由于其较高的遗传同源性，人类和他们的胚胎斑马鱼（ 斑马鱼 ）的透明度已经成为一个重要的脊椎动物模型，并正在越来越多地应用于发育过程，微生物-宿主相互作用，人类疾病，药物筛选等方面的研究4。建立在斑马鱼的癌转移模型可以提供一个答案的啮齿动物模型5,6的缺点。
虽然自发瘤形成在野生斑马鱼7几乎看不到，有几种技术长期以诱导所希望的癌症在斑马鱼。致癌物诱导的基因中的突变或信号传导途径的激活可以在组织学和分子模型癌变，在斑马鱼7，8，9模仿人类疾病。通过德向前荷兰国际集团优势的多样化和反向癌基因或肿瘤抑制基因的基因操作，（转基因）斑马鱼也启用的癌症形成和维持6,10潜力的研究。在斑马鱼的诱发癌症模型涵盖广泛，包括消化，生殖，血液，神经系统和上皮6。
在癌症研究斑马鱼的利用最近扩大归因于这个有机体建立人肿瘤细胞异种移植模型中。这首先与成功，2005年11嫁接在斑马鱼胚胎的囊胚阶段的人类转移性黑素瘤细胞的报道。几个独立的实验室已经通过在不同位点和发育阶段引入哺乳动物癌细胞系不同范围到斑马鱼验证了该开创性工作的可行性5 </ SUP>。例如，胚盘和囊胚期的囊胚注射附近;注射入卵黄囊，卵周隙，居维叶（DOC）的导管，和6-H-后主静脉〜5天龄的胚胎;和注射到30日龄免疫抑制幼虫的腹膜腔中已经执行5,12。此外，还报告了斑马鱼12,13同种异体肿瘤移植。对使用异种移植物的巨大优势是，移植的癌细胞可以很容易地荧光标记，并从正常细胞区分开来。因此，调查的microtumor地层14，细胞侵入和转移15，16，17，肿瘤诱导的血管生成15，1的动态行为8，和癌细胞和宿主之间的相互作用因子17可以在活鱼体被清晰可见，特别是当转基因斑马鱼线被施加5。
通过斑马鱼异种移植物模型的高电位启发来评价转移，我们证明在TG（FLI：EGFP）的尾翼区域不同的乳腺癌细胞系的经血管外渗性质通过文件注射16斑马鱼胚胎。转化生长因子β（TGF-β）16和骨形态发生蛋白的作用（BMP）在促/抗乳腺癌细胞的侵袭和转移19个信号传导途径进行了研究在该模型中。此外，我们还利用概括移植斑马鱼模型与卵周隙注射各种乳腺癌细胞系的血管内的能力进入流通。
<p class ="“jove_content”">本文介绍了基于注射人乳腺癌细胞进入卵周隙或文件斑马鱼异种移植模型中的详细协议。使用高分辨率荧光成像，我们表明血管内到血管和不同的人乳腺癌细胞，其从血管移动到无血管区域尾翼的侵入行为的代表性过程。Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了两个方法来研究乳腺癌细胞中的Tg（FLI1：EGFP）的侵入行为斑马鱼的胚胎，同卵周隙和Doc注射。通过注射标记有化学染料或荧光蛋白引入转基因斑马鱼胚胎癌细胞，侵袭和转移的动态和空间特性可以清楚地在实时的在荧光显微镜下的单细胞或群集水平跟踪。在大多数情况下，转移的斑马鱼中的快速进展确保所述测定法可以在1周内移植之后进行。此外，强大的统计数据可?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究TGF-β家族成员是由癌症基因组学中心荷兰的支持。锡济亚·利和匠人通过在莱顿大学的中国留学基金管理委员会4年的研究支持。我们感谢弗雷德·米勒博士（芭芭拉·安Karmanos癌症研究所，底特律，MI，USA）的MCF10A细胞系。
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
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