Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis
Summary
We beschrijven hier xenograft zebravismodellen behulp van twee verschillende injectieplaatsen, dat wil zeggen, perivitelline ruimte en het kanaal van Cuvier, aan de invasief gedrag te onderzoeken en de intravasation en extravasatie potentieel van menselijke borstkankercellen respectievelijk beoordelen.
Abstract
In veel gevallen hebben kankerpatiënten niet sterven van een primaire tumor, maar eerder als gevolg van metastase. Hoewel tal van knaagdier modellen zijn beschikbaar voor het bestuderen van uitzaaiing van kanker in vivo, worden ook andere efficiënte, betrouwbare, goedkope modellen die nodig zijn om snel toegang te krijgen tot de mogelijke effecten van (epi) genetische veranderingen of farmacologische verbindingen. Als zodanig, we illustreren en uitleg over de haalbaarheid van het xenograft modellen met behulp van menselijke borstkankercellen geïnjecteerd in zebravis embryo's om dit doel te ondersteunen. Onder de microscoop zijn fluorescerende eiwitten of chemisch gemerkte menselijke borstkankercellen getransplanteerd in transgene zebravis embryo, Tg (fli: EGFP), de perivitelline ruimte of kanaal van Cuvier (doe) 48 uur na bevruchting. Kort daarna is de tijdruimtelijke proces van kankercel invasie, verspreiding, en metastase in het levende vis lichaam zichtbaar gemaakt onder een fluorescentiemicroscoop. De modellen met behulp van verschillende injectieplaatsen, dat wil zeggen, perivitelline ruimte of Doc complementair aan elkaar, als gevolg van de vroege fase (intravasation stap) en de late fase (stap extravasatie) van de meerstaps metastatische cascade van gebeurtenissen. Bovendien kan peritumorale en intratumorale angiogenese worden waargenomen met de injectie in de perivitelline ruimte. De gehele experimentele periode is niet meer dan 8 dagen. Deze twee modellen combineren cel labeling, micro-transplantatie, en fluorescentie beeldvormende technieken, waardoor de snelle evaluatie van kanker metastase in reactie op de genetische en farmacologische manipulaties.
Introduction
Openlijke uitzaaiing in de kliniek omvat een reeks complexe en multi-step events zogenaamde "metastatische cascade". De cascade is uitvoerig beoordeeld en kan worden ontleed in opeenvolgende stappen: de lokale invasie, intravasation, verspreiding, arrestatie, extravasatie, en kolonisatie 1, 2. Een beter begrip van de pathogenese van kanker metastase en de ontwikkeling van potentiële therapeutische strategieën in vivo vereisen robuuste gastheer modellen van kankercel te verspreiden. Knaagdiermodellen zijn goed ingeburgerd en worden veel gebruikt voor metastase 3 evalueren, maar deze benaderingen hebben lage efficiëntie en ethische beperkingen en zijn kostbaar als voorgrond model om te bepalen of een bepaalde manipulatie kunnen hebben voor de metastatische fenotype. Andere efficiënte, betrouwbare, goedkope modellen zijn nodig om snel toegang te krijgen tot de mogelijke effecten van (epi) genetische veranderingen of pharmacologsche verbindingen. Vanwege hun hoge genetische homologie voor mens en transparantie van de embryo zebravis (Danio rerio) naar voren gekomen als een belangrijke gewervelde model en worden steeds meer toegepast voor het onderzoek van ontwikkelingsprocessen, microbe-gastheer interacties, menselijke ziekten, screening van geneesmiddelen, enz . 4. De in de zebravis gevestigde uitzaaiing van kanker modellen kunnen een antwoord op de tekortkomingen van knaagdiermodellen 5, 6 te bieden.
Het spontaan neoplasie nauwelijks is te zien in wild zebravis 7, zijn er verschillende langdurige technieken om de gewenste kanker in zebravis induceren. Carcinogeen-geïnduceerde genmutaties of signaleringsroute activering kan histologisch en moleculair model carcinogenese, nabootsen menselijke ziekte zebravis 7, 8, 9. door taking maken van diverse voorwaartse en omgekeerde genetische manipulaties van oncogenen of tumor suppressors, (transgene) zebravis konden ook potentieelstudies van vorming en instandhouding 6, 10 kanker. De geïnduceerde kankermodellen in zebravis bestrijken een breed spectrum, zoals spijsvertering, voortplanting, bloed, zenuwstelsel en epitheliale 6.
Het gebruik van zebravis in kankeronderzoek is onlangs uitgebreid als gevolg van de oprichting van de menselijke tumorcel xenograft modellen in dit organisme. Dit werd voor het eerst gemeld met menselijke gemetastaseerd melanoom cellen die met succes werden geënt in zebravis embryo's in het blastula stadium in 2005 11. Verschillende onafhankelijke laboratoria hebben de haalbaarheid van dit pionierswerk gevalideerd door het inbrengen van een breed scala van zoogdierlijke kankercellen lijnen in zebravis op verschillende plaatsen en ontwikkelingsstadia 5 </ Sup>. Bijvoorbeeld injecties bij de blastoschijf en blastocyst van het blastula stadium; injecties in de dooierzak, perivitelline ruimte, kanaal van Cuvier (Doc), en achterste hoofdader van 6-H- tot 5 dagen oude embryo's; en injecties in de buikholte van de 30-dagen oude immuungesuppresseerde larven zijn uitgevoerd 5, 12. Bovendien werden allogene transplantaties tumor ook vermeld in zebravis 12, 13. Een van de grote voordelen van het gebruik van xenotransplantaten is dat de geënte kankercellen kan gemakkelijk fluorescerend gemerkt en onderscheiden van normale cellen. Derhalve onderzoek naar het dynamische gedrag van microtumor formatie 14 cellen invasie en metastase 15, 16, 17, door tumor geïnduceerde angiogenese 15, 18, en de interacties tussen kankercellen en gastheerfactoren 17 duidelijk worden gevisualiseerd in levende vislichaam, vooral wanneer transgene zebravis lijnen toegepast 5.
Geïnspireerd door het grote potentieel van zebravis xenograftmodellen metastase evalueren we aangetoond dat de transvasculaire extravasatie eigenschappen van verschillende borstkanker cellijnen in de staartvin gebied van Tg (Amst: EGFP) zebravis embryo's door middel van Doc injecties 16. De rol van transforming growth factor-β (TGF-β) 16 en bot morfogenetisch proteïne (BMP) 19 signaalwegen in pro- / anti-borstkankercellen invasie en metastase werden ook onderzocht in dit model. Bovendien hebben we recapituleerde ook de intravasation vermogen van verschillende borstkanker cellijnen in het verkeer met behulp van xenograft zebravismodellen met perivitelline ruimte injecties.
<p class = "jove_content"> Dit artikel presenteert gedetailleerde protocollen voor zebravis xenograft modellen gebaseerd op de injectie van humane borstkankercellen in de perivitelline ruimte of doe. Met behulp van hoge-resolutie fluorescentie beeldvorming, tonen we de representatieve werkwijze van intravasation in bloedvaten en het invasieve gedrag van andere menselijke borstkankercellen, die zich van de bloedvaten in de avasculaire zone staartvin.Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreven we twee methoden om de invasief gedrag van borstkankercellen in Tg (fli1: EGFP) onderzoeken zebravis embryo's, met perivitelline ruimte en Doc injecties. Door het injecteren van kankercellen gelabeld met chemische kleurstof of fluorescent eiwit in transgene zebravis embryo, kan de dynamische en ruimtelijke eigenschappen van invasie en metastase duidelijk worden bijgehouden in real time bij de enkele-cel of cluster niveau onder een fluorescentiemicroscoop. In de meeste gevallen, de snelle pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studies over TGF-β familieleden worden ondersteund door het Cancer Genomics Centre Nederland. Sijia Liu en Jiang Ren worden ondersteund door de China Scholarship Council voor 4 jaar van studie aan de Universiteit van Leiden. Wij danken Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) voor de MCF10A cellijnen.
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
