Comportamento invasiva de células de cancro da mama humano em Embryonic Zebrafish

Summary

Aqui, descrevemos modelos peixe-zebra xenotransplante usando dois locais de injecção diferentes, ou seja, espaço perivitelínico e duto de Cuvier, para investigar o comportamento invasivo e avaliar a intravasation e extravasamento potencial das células de câncer de mama humanos, respectivamente.

Abstract

Em muitos casos, pacientes com câncer não morrer de um tumor primário, mas sim por causa da metástase. Embora numerosos modelos de roedores estão disponíveis para estudar a metástase do cancro in vivo, outros modelos eficientes, fiáveis e de baixo custo são necessários para aceder rapidamente os efeitos potenciais de (epi) alterações genéticas ou compostos farmacológicos. Como tal, nós ilustrar e explicar a viabilidade de modelos de xenoenxerto utilizando células de cancro da mama humanas injectadas em embriões de peixe-zebra para suportar este objectivo. Sob o microscópio, proteínas fluorescentes ou células de cancro da mama humano quimicamente marcados são transplantadas em embriões de peixes-zebra transgénicos, Tg (fli: EGFP), no espaço perivitelino ou ducto de Cuvier (DOC) 48 h após a fertilização. Pouco depois, o processo temporal-espacial da invasão da célula cancerosa, disseminação e metástase no corpo do peixe vivo é visualizada sob um microscópio fluorescente. Os modelos que utilizam diferentes locais de injecção, isto é, porespaço ivitelline ou doe são complementares um ao outro, o que reflecte a fase inicial (passo intravasamento) e fase tardia (passo extravasamento) da cascata metastática de várias etapas de eventos. Além disso, a angiogénese peritumoral e intratumoral pode ser observada com a injecção no espaço perivitelino. O período experimental todo não mais do que 8 dias é. Estes dois modelos combinam marcação celular, micro-transplante, e as técnicas de imagiologia de fluorescência, permitindo a avaliação rápida de metástase do cancro em resposta a manipulações genéticas e farmacológicas.

Introduction

metástase do cancro manifesta na clínica compreende uma série de eventos complexos e multi-passo conhecido como o "cascata metastática". A cascata tem sido extensivamente revisado e pode ser dissecado em etapas sucessivas: a invasão local, intravasation, difusão, Detenção, extravasamento e colonização ^{1, 2.} Uma melhor compreensão da patogênese da metástase do câncer e o desenvolvimento de potenciais estratégias de tratamento in vivo requerem modelos de acolhimento robustas de disseminação de células cancerígenas. Modelos de roedores estão bem estabelecidos e são largamente utilizados para avaliar a metástase ^3, mas estas abordagens têm baixa eficiência e limitações éticos e são dispendiosos como um modelo de vanguarda para determinar se uma manipulação particular poderia afectar o fenótipo metastático. Outros modelos eficaz, fiável e de baixo custo são necessários para aceder rapidamente os efeitos potenciais de (epi) alterações genéticas ou pharmacologcompostos ical. Devido à sua elevada homologia genética para os seres humanos e a transparência da sua embriões de peixe-zebra (Danio rerio) têm emergido como uma importante modelo de vertebrado e estão a ser cada vez mais aplicada ao estudo de processos de desenvolvimento, interacções micróbio-hospedeiro, doenças humanas, o rastreio de fmacos, etc. . ^4. Os modelos de metástase cancerosa estabelecidos no peixe-zebra pode proporcionar uma resposta às deficiências dos modelos de roedores ^{5, 6.}

Embora neoplasia espontânea é dificilmente visto em peixes-zebra selvagem ^7, existem várias técnicas de longa data para induzir o cancro desejado em peixes-zebra. Mutações de genes induzida por carcinogénico ou activação da via de sinalização pode histologicamente e carcinogénese modelo molecularmente, simulando doença humana em peixes-zebra ^{7, 8, 9.} por taking vantagem de diverso para a frente e reverso manipulações genéticas de oncogenes ou supressores de tumor, (transgénicos) do peixe-zebra também permitiram potenciais estudos de formação e de manutenção ^{6, 10} cancro. Os modelos de cancro induzidos em peixes-zebra cobrir um largo espectro, incluindo digestivo, reprodutivo, sangue, sistema nervoso, epitelial e ^6.

A utilização do peixe-zebra na pesquisa do câncer recentemente expandiu devido ao estabelecimento de modelos de xenotransplante de células tumorais humanas neste organismo. Este foi relatada pela primeira vez com células de melanoma humano metastático que foram enxertadas com sucesso em embriões de peixe zebra na fase de blástula em 2005 ^11. Vários laboratórios independentes validada a viabilidade deste trabalho pioneiro através da introdução de uma grande variedade de linhas de células cancerosas de mamífero em peixes-zebra em vários locais e estágios de desenvolvimento ^{5 <}/ Sup>. Por exemplo, injecções perto do blastodisco e blastocisto da fase de blástula; injecções no saco vitelino, espaço perivitelino, ducto de Cuvier (DOC), e veia cardinal posterior de 6-h- de embriões de 5 dias de idade; e injecções na cavidade peritoneal de larvas imunossuprimidos de 30 dias de idade, foram realizados ^{5, 12.} Adicionalmente, os transplantes de tumor alogénico também foram relatados em peixes-zebra ^{12, 13.} Uma das grandes vantagens da utilização de xenoenxertos é que as células cancerosas enxertada pode ser facilmente marcado por fluorescência e distinguido a partir de células normais. Por conseguinte, as investigações sobre os comportamentos dinâmicos de formação microtumor ^14, a invasão de células e metástase ^{15, 16, 17,} a angiogénese induzida por tumores ^{15, 1}8, e as interacções entre as células cancerosas e factores do hospedeiro ¹⁷ pode ser claramente visualizada no corpo do peixe vivo, especialmente quando as linhas de peixes-zebra transgénicos são aplicados ^5.

Inspirado pelo alto potencial de modelos de xenoenxerto de peixe-zebra para avaliar metástases, que demonstraram as propriedades de extravasamento transvascular de diferentes linhas celulares de cancro da mama na área de tailfin de Tg (fli: EGFP) embriões de peixe-zebra através de injecções Doc ^16. O papel do factor de crescimento transformante-β (TGF-β) proteína ^{de 16} e osso morfogenética (BMP) ¹⁹ vias de sinalização na invasão de células de cancro da pró / anti-mama e de metástases foram também investigados neste modelo. Além disso, também a capacidade recapitulado intravasamento de várias linhas celulares de cancro da mama em circulação, utilizando modelos de xenoenxerto de peixe-zebra com injecções espaço perivitelino.

<p class = "jove_content"> Este artigo apresenta protocolos detalhados para os modelos de xenotransplante de peixe-zebra com base na injeção de células de câncer de mama humanos para o espaço perivitelínico ou Doc. Utilizando imagiologia de fluorescência de alta resolução, que mostram o processo representativo de intravasamento em vasos sanguíneos e o comportamento invasivo de diferentes células de cancro da mama humano, que se movem a partir dos vasos sanguíneos na área tailfin avascular.

Protocol

Todas as pesquisas usando o transgênico fluorescente Tg peixe-zebra (FLI: EGFP) tensão, que tem reforçado a proteína verde fluorescente (EGFP) marcado com vasculatura 20, incluindo a habitação e os experimentos, foi realizado de acordo com as diretrizes internacionais e foi aprovado pelo Comitê Institucional local for animal Welfare (Dier Ethische Commissie (DEC) do Centro Médico da Universidade de Leiden. NOTA: Como resumido na Figura 1, o protocolo é aproximadamente dividi…

Representative Results

No modelo de xenoenxerto de peixe-zebra embrionários com uma injecção espaço perivitelino, o disseminação hemática das células cancerosas marcadas no corpo do peixe é considerado como activo migração. Este processo pode ser detectado e quantificado sob um microscópio de fluorescência, tal como descrito nos métodos acima. Para ilustrar este modelo de xenoenxerto, seguimos o processo de difusão de diferentes linhas celulares de cancro da mama com conhecida (ou sem) invasão …

Discussion

Aqui, são descritos dois métodos para investigar o comportamento invasivo das células cancerosas da mama em Tg (FLI1: EGFP) embriões de peixe-zebra, com espaço perivitelino e Doc injecções. Através da injecção de células cancerosas marcadas com corante químico ou proteína fluorescente em embriões de peixes-zebra transgénicos, as características dinâmicas e espaciais de invasão e metástase pode ser claramente rastreados em tempo real na parte de uma única célula ou nível de agregados sob um…

Materials

Agarose	MP Biomedicals	AGAF0500
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus	300038
Cholera enterotoxin	Calbiochem	227035
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
DMEM-high glucose media containing L-glutamine	ThermoFisher Scientific	11965092
DMEM/F-12 media containing L-glutamine	ThermoFisher Scientific	21041025
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc	11252-20
Epidermal growth factor	Merck Millipore	01-107
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	16140071
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
HEK293T cell line	American Type Culture Collection	CRL-1573
Hydrocortisone	SigmaAldrich	227035
Horse serum	ThermoFisher Scientific	26050088
Insulin	SigmaAldrich	I-6634
MCF10A (M1) cell line			Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)
MCF10Aras (M2) cell line			Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)
MDA-MB-231 cell line	American Type Culture Collection	CRM-HTB-26
Manual micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul)	Eppendorf	F276456I
pCMV-VSVG plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
PLV-mCherry plasmid	Addgene	36084
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Pneumatic picoPump	World Precision Instruments	SYS-PV820
Polybrene	SigmaAldrich	107689
Prism 4 software	GraphPad Software
pRSV-REV plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Tris-base	SigmaAldrich	11814273001
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040
Trypsin-EDTA (0.5%)	ThermoFisher Scientific	15400054
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm)	SigmaAldrich	P5481-500EA
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040