Summary
Здесь мы описываем метод быстрого равновесного диализа (RED) для измерения связывания лекарственного средства с казумом от поражений и полостей легочного туберкулеза. Протокол также используется с матрицей, полученной из пенистого макрофага, которая является эффективным суррогатом казума.
Abstract
Для искоренения туберкулеза необходимы схемы лекарств, которые могут проникать во множество слоев сложных легочных очагов. Распределение лекарств в казеозных ядрах полостей и поражений особенно важно, поскольку они содержат субпопуляции лекарственно-толерантных бактерий, которые также часто называют персистерами. Существующие методы измерения проникновения лекарств в очаги туберкулеза требуют дорогостоящих и длительных исследований фармакокинетики in vivo в сочетании с методами биоанализа или визуализации. В качестве альтернативы таким методам было предложено измерение связывания лекарства с макромолекулами кадьюма in vitro, поскольку это связывание препятствует пассивной диффузии молекул лекарственного средства через казум. Быстрорадикальный диализ - это быстрая и надежная система для проведения исследований связывания с белками плазмы и тканей. В этом протоколе мы использовали прибор с быстрым равновесным диализом (RED) для измерения связывания лекарственного средства с гомогенатами казума, который представляет собой эксцизиюВызванных поражениями и полостями инфицированных туберкулезом кроликов. Протокол также описывает, как создать суррогатную матрицу из макрофагов THP-1, нагруженных липидами, для использования вместо казума. Этот анализ казума / суррогатного связывания является важным инструментом при обнаружении лекарств от туберкулеза и может быть адаптирован для изучения распределения лекарственных средств при поражениях или абсцессах, вызванных другими заболеваниями.
Introduction
Лечение туберкулеза легких требует эффективного распределения препаратов в различных типах поражений. Некротические поражения и полости содержат казеозные центры, которые содержат субпопуляции лекарственно-устойчивых или «стойких» бактерий. 1 , 2 Кавитационная болезнь связана с низкими показателями излечения и плохим прогнозом. 3 , 4 Предыдущие исследования показали, используя количественные методы и методы визуализации, что способность проникать в казуум значительно варьирует от одного класса наркотиков к другому. 5 , 6 Эти методы, однако, требуют использования моделей заражения животных, которые являются медленными и утомительными. Был разработан тест in vitro, который измеряет связывание лекарственного средства с ex vivo caseum. Было установлено, что это связывание обратно коррелирует с проникновением лекарств в казеозные гранулемы и, следовательно, являетсяиспользуется в качестве инструмента прогнозирования. 7
Равновесие диализ рассматриваются как золотой стандарт подхода к белкам плазмы исследованию связывания. Быстрый равновесный диализ (RED) устройство обеспечивает быструю, легкую в использовании и надежную систему для выполнения таких анализов. 8 Устройство состоит из двух компонентов: одноразовое использование, одноразовых вкладышей , состоящих из 2 -х камер , разделенных вертикального цилиндра полупроницаемой мембраны; и повторно используемые базовые пластины, которые могут содержать до 48 вставок в то время. Диализ мембрана имеет 8 кД молекулярной массы срез (MWCO), что идеально подходит для исследования связывания с наркотиками макромолекулы. Высокое отношение площади поверхности к объему мембранного отсека позволяет быстро диализ и уравновешивание. Обе вставка и базовая пластина были проверены для минимально неспецифического связывания. Сочетание RED устройства с биоаналитическими методами обеспечивает точные оценки несвязанных фракций лекарственных средств в рЛАЗМА. 8, 9
Хотя первоначально предназначено для измерения связывания с белками плазмы, КРАСНОЕ устройство используется в нескольких тканях исследования связывания с использованием гомогенат. 10, 11 В этом протоколе, мы оцениваем препарат связывания с caseum, некротическим мусор вырезал из некротических поражений и полостей туберкулеза-инфицированных кроликов. Бесклеточное и не сосудистое характер казеозного материала позволяет легко гомогенизировать в гомогенную суспензию, который совместит с анализом.
Учитывая, что caseum утомительно производить и трудно найти, протокол также был утвержден для использования с суррогатной матрицей, получают из пенистых макрофагов. ТНР-1 моноцитов макрофаги индуцируются с олеиновой кислотой, чтобы накопить несколько липидных тел, которые дают им их «пенистый» внешний вид. Эти липидные загруженные клетки собирают иОбрабатывается для получения матрицы, которую мы используем в качестве суррогата caseum. Это исследование показало, что связывание лекарственного средства с этой суррогатной матрицей хорошо коррелирует со связыванием с казумом, эффективно имитируя процесс in vivo , который препятствует проникновению наркотиков в казеозную сердцевину гранулем и полостей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья с одобрения Комитета по институциональному уходу и использованию животных NIAID (NIH), Bethesda, MD. Все исследования с участием M. tuberculosis проводились в лаборатории с уровнем биологической безопасности 3 (BSL-3).
1. Модель заражения кроликов и коллекция казума
- Инфицируйте белых кроликов Новой Зеландии с M. tuberculosis, используя аэрозольную систему воздействия носа только, как описано выше. 12 , 13 Позвольте инфекции прогрессировать в течение 12-16 недель. Седате кроликов с 35 мг / кг кетамина и 5 мг / кг ксилазина внутримышечно, эвтаназии кроликов с 0,22 мл / кг пентобарбитала натрия и фенитоин натрия внутривенно и приступить к вскрытии.
- Используя пинцеты и скальпель, удалите легкие из сундука caVity. Из каждой легочной доли вырезают отдельные полости и крупные некротические гранулемы с помощью скальпеля. Тщательно очистите казум от полостей и гранулемы. Взвешивают, записывают и хранят образцы в пробирках с 2-миллилитровыми пробками при -20 ° C до готовности к использованию.
- Гамма-облучение образцов инфекционного кадзума в 3 MegaRad на сухом льду, чтобы сделать их неинфекционными и безопасными для использования в лаборатории BSL-2.
2. In vitro генерирование суррогата кардиума из клеток ТНР-1
- Выращивают моноциты THP-1 в среде RPMI 1640 (2 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки) в колбах для культивирования клеток Т175 (80 мл / колбу). Инкубируйте колбы в атмосфере 5% CO 2 при 37 ° C в течение 3-4 дней.
- Центрифуга культуры из T175 колбу в двух 50 мл конических труб на 150 xg в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и суспендируйте осадок в 10 мл среды RPMI 1640.
- Внесите 5 мкл этой культуры в 1,5 мл пробирку, содержащую 45 мкл tRypan голубой. Тщательно перемешать с помощью пипетки. Перенесите 10 мкл на гемоцитометр и подсчитайте количество жизнеспособных моноцитов THP-1 (неокрашенных), используя световой микроскоп (10-кратное увеличение). Рассчитайте количество жизнеспособных клеток на мл культуры. Разбавьте его средой RPMI до конечной плотности 1,25 × 10 6 клеток / мл.
- Нагрузка 40 мл культуры на большой планшет для культуры клеток (50 × 10 6 клеток / планшета). Добавить 40 мкл 100 мкМ РМА (форбол 12-миристат-13-ацетата, приготовленного в этаноле) и позволить клеткам прилипать в течение ночи в инкубаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация PMA составляет 100 нМ. - Разбавляют чистую олеиновую кислоту (ОА) (0,89 г / мл) в этаноле до концентрации 0,1 М ( то есть 31,7 мкл ОА в 968,3 мкл этанола). Развести этот раствор в свежей предварительно нагретой среде RMPI до концентрации 10 мМ. Развести эту суспензию ОА до 0,4 мМ (конечная рабочая концентрация) в среде RPMI, предварительно нагретой до 37 ° С.
- Удалить существующие носители и-adhered клетки из клеточной культуры пластин и осторожно добавляют 40 мл 0,4 мМ ОА в макрофагах THP-1 (ТНР-M). Инкубируют при 37 ° С в инкубаторе в течение ночи.
- С помощью светового микроскопа при 40-кратном увеличении, чтобы визуально подтвердить наличие многочисленных липидных включений тела в каждом ТНР-М. Удалить все среды RPMI из клеточной культуры пластин и осторожно вымыть прилипшие клетки дважды фосфатно-буферный раствор (PBS) с помощью серологической пипетки на 50 мл.
Примечание: липидные тела появляются как маленькие, четкие, сферические структуры в цитоплазме ТНР-М. - Добавить 40 мл 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в PBS в каждую чашку. Инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С.
- Отсоедините пенистые макрофаги (FM), несколько раз пипетирования вверх и вниз по поверхности всей пластины с помощью серологической пипетки 10 мл. Передача клеточной суспензии в коническую пробирку на 50 мл и спином вниз со скоростью 150 мкг в течение 5 мин.
- Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл PBS (третий промывной PBS), ай передаче предварительно взвешенные конические пробирки 15 мл. Спин вниз снова при 150 мкг в течение 5 мин. Тщательно аспирата супернатант с помощью серологической пипетки и выбросьте.
- Тема с FM гранул до 3 циклов замораживания-оттаивания, чтобы лизировать клетки, и инкубируют их при 75 ° С в течение 20-30 мин для денатурации белков в матрице. Храните гранулы при температуре -20 ° С до готовности к использованию.
3. Быстрое Уравновешивание Диализ (КРС) Анализ
- Готовят 10 мМ исходные растворы всех исследуемых соединений в диметилсульфоксиде (ДМСО). Разбавить до 500 мкМ рабочих растворов в ДМСО до каждого анализа.
- Взвесить трубку, содержащую caseum суррогатной осадок. Отнимите вес порожней трубки, чтобы получить вес гранул в одиночку. Добавьте 2-3 металлические шарики на пробирку и, используя гомогенизатор ткани на 1200 ударов / мин в течение 1 мин, нарушить caseum или суррогатной матрицу в PBS (1: 9 вес / объем), чтобы достичь 10x разбавленной суспензии каждой матрицы.
- Spike 6,5 мкл 500МкМ раствора испытуемого соединения в 643,5 мкл гомогената для достижения конечной концентрации 5 мкМ (≤1% ДМСО) и вихря.
- Поместите КРАСНЫЕ вставки в основание. Добавить 200 мкл матрицы с лекарственным покрытием в донорную камеру (красное кольцо) каждой красной вставки и 350 мкл PBS в каждую камеру-приемник. Подготовьте 3 вставки для каждого испытуемого соединения (образцы из трех экземпляров). Уплотнительную пластину с клеевым пластинчатым уплотнением и инкубировать при температуре 37 ° С на термомиксере при 200 об / мин (1 xg) в течение 4 часов.
- После инкубации аккуратно перемешайте содержимое донорской и приемной камер с помощью пипетки вверх и вниз 2-3 раза. Внесите 20 мкл аликвоты гомогената из донорных камер и добавьте 20 мкл чистого PBS в 1,5 мл пробирку (1: 1). Аналогичным образом, пипеткой из 20 мкл аликвоты образцов PBS из приемной камеры и добавить 20 мкл чистого гомогената (матрица соответствия). 8
ПРИМЕЧАНИЕ. Матричное сопоставление исключает ne2-й изд отдельных калибровочных кривых (в гомогенате и PBS) должны быть сделан для количественного анализа. Содержание донора камеры может осаждаться в течение долгого времени. Аккуратно перемешать содержимое с помощью пипетки перед удалением аликвоты.
4. ЖХ-МС Количественное и анализ данных
- Добавьте 160 мкл 1: 1 метанол: ацетонитрил, содержащий 500 нг / мл диклофенак или 10 нг / мл верапамил (внутренний стандарт) в каждую пробирку и вихря для осаждения белков. Центрифуга при 10000 мкг в течение 5 мин для осаждения осадок и переноса супернатантов в 96-луночные глубоко-луночные планшеты для жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) анализа. 7
- Построение калибровочных кривых от 1-1000 нМ для каждого испытуемого соединения, сохраняя при этом тот же состав, как матрицу образцов выше. Количественно концентрацию тестируемого соединения в образцах от донора и приемника камеры с использованием метода ЖХ-МС.
- Вычислить несвязанного фракции (е и) оF препарат в разбавленной матрице, используя уравнение 1. Вычислить f u в неразведенной матрице, используя уравнение 2 ( D = коэффициент разбавления 10). 14
- Проверьте восстановление (баланс массы) каждого соединения, используя уравнение 3 для идентификации соединений с проблемами стабильности / метаболизма / неспецифического связывания.
ПРИМЕЧАНИЕ. Восстановление обычно составляет от 70% до 130%. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол, мы опробовали сотни препаратов для разработки лекарств против туберкулеза для их прогнозируемой эффективности в проникающем казуме. На рисунке 1 представлены основные понятия анализа RED. Диализная мембрана красных вставок позволяет несвязанным небольшим молекулам диффундировать из донорской лунки в лунку приемника, в конечном итоге достигая равновесия между обоими отсеками. Небольшие молекулы, которые связаны с макромолекулами, такими как белки или липиды, задерживаются в донорской лунке. Количественный анализ проб из обоих отсеков позволяет рассчитать несвязанную фракцию ( f u ) каждой малой молекулы в казуме или суррогатной матрице. Было показано, что эта фракция непосредственно коррелирует с проникновением наркотиков в казум in vivo . 7 Как показано на рисунке 2, с использованием масс-спектрометра MALDI (лазерная десорбция / ионизация матрицы)Метрические изображения, чем выше f u , тем шире распространяется препарат в казум. Следовательно, это согласуется с гипотезой о том, что, поскольку молекулы лекарственного средства диффундируют во внешний край казума из его границы с клеточными слоями поражения, связывание с казеозными макромолекулами связывает лекарство, предотвращая его дальнейшую диффузию в казеозное ядро. Примерная группа из 18 противотуберкулезных препаратов приведена в Таблице 1 вместе с их f u как в казуме, так и в суррогате. Как показано на рисунке 3 , матрица, полученная из пенистых макрофагов, полученных из THP-1, является эффективным суррогатом для истинного казума. Связывание в обеих матрицах сильно коррелирует друг с другом.
Рисунок 1: Иллюстрация анализа RED. Во время инкубации молекулы лекарств, которые остаются несвязанными с макромолекулами вМатрица диффундирует через диализную мембрану. Со временем устанавливается равновесие между концентрацией несвязанных молекул лекарственных веществ как в донорской, так и в приемной скважинах. Все макромолекулы (белки, липиды и т. Д.) И связанные молекулы лекарственного средства попадают в камеру-донор. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Проникновение наркотиков in vivo . Связь между несвязанной фракцией ( f u ) и диффузией в казум in vivo, как определено с помощью масс-спектрометрии MALDI (матричная лазерная десорбция / ионизация) для шести противотуберкулезных препаратов. Ионные карты представляют характерные легочные повреждения, а интенсивность сигнала указана шкалой слева. ЧАС Эматоксилин и эозин (H & E) прилегающих участков показаны ниже ионных карт. Черно-белые контурные линии выделяют казеозный центр каждого очага поражения. Перепечатано (адаптировано) с разрешения Sarathy et al . 7 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Корреляция между несвязанными фракциями ( f u ) 18 противотуберкулезных препаратов в казуме и суррогатной матрицей. Линию наилучшего соответствия определяли с использованием линейной регрессии. Хорошее соответствие выражается как значение R 2 . Перепечатано (адаптировано) с разрешения Sarathy et al . 7K "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Caseum f u (%) | Суррогатное суждение (%) | |
этамбутол | 35,2 ± 4,4 | 38,8 ± 5,6 |
Изониазид | > 99,9 | > 99,9 |
Ацетил-изониазид | > 99,9 | > 99,9 |
П- аминосалициловая кислота | 54,7 & plusmn; 1,4 | 51,1 ± 11,2 |
Рифампицин | 5,13 ± 0,2 | 7,3 ± 0,6 |
Rifapentine | 0,5 ± 0,1 | 1,1 ± 0,1 |
Моксифлоксацин | 13,5 ± 3,7 | 16,8 ± 1,8 |
Левофлоксацин | 8,34 ± 0,4 | 16,3 ± 3,1 |
Gatifloxacin | 16,3 ± 4,2 | 18,8 ± 2,9 |
Линезолид | 29,3 ± 3,6 | 27,9 ± 2,2 |
Posizolid | 10,7 ± 1,7 | 17,6 ± 4,5 |
Sutezolid | 30,1 ± 8,7 | 21,7 ± 1,7 |
Radezolid | 5,2 ± 0,8 | 7,6 ± 1,9 |
тедизолид | 8,8 ± 1,8 | 13,7 ± 2,7 |
Клофазимин | <0,01 | <0,01 |
Bedaquiline | <0,01 | <0,01 |
PA-824 | 7,31 ± 2,2 | 3,6 ± 0,2 |
OPC67683 | 0,04 ± 0,02 | 0,02 ± 0,002 |
Таблица 1: Несвязанная фракция ( f u ) 18 ТБ лекарств, испытанная в казуме и суррогатном анализе связывания. Все результаты выражаются как среднее ± стандартное отклонение. Перепечатано (адаптировано) с разрешения Sarathy et al . 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Легочные некротические поражения и полости у больных туберкулезом содержат субпопуляции бактерий, которые не поддаются лечению. Казеозные ядра этих структур особенно ответственны за укрывательство этих персистеров во внеклеточной среде. Благоприятное распределение антибактериальных агентов в этих отдаленных местах считается важным фактором, определяющим эффективность лекарственного средства для лечения туберкулеза. До проверки этого протокола не было доступных методов in vitro, которые могли бы предсказать распределение соединений для обнаружения лекарств в казеозных поражениях. В результате оценка распределения лекарственного средства в этих критических очагах в значительной степени зависела от моделей заражения животных, ориентированных на поражение фармакокинетических исследований и методов визуализации масс-спектрометрии MALDI. 5 , 17
Анализ in vitro показал, что онповторно это быстрый и эффективный способ предсказать проникновение наркотиков в поражениях туберкулеза без утомительного и стоимости фармакокинетических исследований в естественных условиях. Протокол представляет собой модификацию белков плазмы анализа связывания, который был первоначально предполагаемое использование RED устройства. Гомогенизация образцов ткани с пипеткой-состоянием консистенции позволяет тканевый белок связывания быть измерено с использованием того же устройства. Этот протокол может быть проведен с caseum, если она доступна на моделях инфекции животных. Как показано на рисунке 1 , объясняет, молекулы препарата связываются с макромолекул в caseum / суррогатной гомогената, держа его в донорной камере, в то время как несвязанные молекулы препарата могут свободно диффундировать через полупроницаемую мембрану в камеру приемника. Несвязанных фракция (е и) уравновешивает между обоими отделениями в течение инкубационного периода. Как показано на рисунке 2 показано, очень высоко связаны соединения (F U ≤ 1%) , которые являются AlmoSt, полностью захваченные в донорской камере, неэффективны в проницаемом казуме. С другой стороны, менее связанные соединения (1% < f u <100%) способны диффундировать в казеозное ядро в различной степени; Чем выше f u , тем более интенсивно он пронизывает некротическую область.
Протокол также может быть использован с суррогатной матрицей, полученной из макрофагов THP-1, нагруженных липидами, которые были индуцированы олеиновой кислотой. Несколько условий для индукции накопления липидного тела были испытаны на THP-1. К ним относятся гипоксия, облучение M. tuberculosis и воздействие 6,6'-димиколатом трегалозы (TMD), происходящим из стенки микобактериальных клеток. Было доказано, что конечная концентрация инкубации олеиновой кислоты 400 мкМ вызывает образование пика пикового липида без ущерба для жизнеспособности и адгезии клеток. 7 Разбавление олеиновой кислоты в предварительно нагретых средах является критическим для обеспечения максимумовЛ растворения жирной кислоты. Полученная суррогатная матрица имеет сравнимое содержание холестерина с истинным казумом, но с более высоким и низким содержанием триглицеридов и протеинов, соответственно. Как показано на рис. 3, связывание 18 противотуберкулезных соединений с суррогатной матрицей сильно коррелирует с их связыванием с казумом. Недавнее исследование, которое также включало некоммерческие соединения с неопределенной бактерицидной активностью, показало, что полученная из ФМ матрица является эффективным суррогатом казума. 7 Устраняя необходимость в моделях заражения животных, суррогатная матрица успешно увеличивает пропускную способность этого анализа, делая его более рентабельным.
Этот универсальный протокол также может быть использован для одновременного тестирования нескольких соединений (тест кассет). Ранее мы показали, что тестирование 5 комбинаций лекарств, все в 5 мкМ, в каждой вставке с использованием этого протокола может эффективно ранжировать соединениеы на основе их caseum аффинности связывания, экономя время и материалы. Шестое управление соединение, таким как моксифлоксацин может быть добавлено к кассете в качестве внутреннего контроля, чтобы обеспечить согласованность между анализами и партиями caseum / суррогатом. 7 Важно отметить, что протокол может быть запущен с всего лишь 20 мкл 10 мМ соединение запаса (<< 1 мг соединения). Это огромное преимущество на ранней стадии в процессе обнаружения наркотиков, когда химики синтезируют ограниченное количество каждого соединения для целей скрининга. Устройство RED устройств являются автоматизацией дружеской; микроплансает след опорной плиты делает его совместимым с автоматизированными системами, предназначенных для обработки стандартных 96-луночных планшетов.
Несмотря на то, суррогатную матрицу , как была показана , чтобы успешно имитировать связывающие свойства экс виво caseum (рисунок 3) мы признаем , что она может неточно определенные соединения в профиле. ТНР-1 макрофаги обычно используются в Caseum суррогатного анализ связывания является полезным инструментом в обнаружении наркотиков туберкулеза и в настоящее время используется в нескольких программах оптимизации свинца. Она также может помочь разработать более эффЭффективные комбинированные режимы, основанные на способности отдельных лекарств разбиваться на различные слои множественных типов поражения. Протокол также может быть адаптирован для облегчения открытия лекарственного средства для других заболеваний, которые характеризуются образованием повреждений или абсцессов, где проникновение наркотиков ограничено, но важно для успешного лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конкурирующих финансовых интересов нет.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Johnson & Johnson, Альянс TB, Astra Zeneca, Rib-X и Триус Therapeutics для обеспечения bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid и тедизолид соответственно. Брендан Прайдо, Мэтью Циммерман, Стивен Джузвин, Эмма Рей-Хурадо, Нэнси Руел, Льян Ли и Даниэла Вайнер оказывал поддержку с анализом MALDI, биоаналитических методов, подготовки caseum суррогата, химический синтез и выделение кролика caseum. Эта работа была проведена при финансовой поддержке Фонда Билла и Мелинда Гейтс, удостоенный # OPP1044966 и OPP1024050 к V Дартуа, NIH Shared Instrumentation Грант S10OD018072, а также совместного финансирования со стороны Фонда Билла и Мелинды Гейтс и Wellcome Trust для центра передового опыта для свинца оптимизации для болезней развивающегося мира P Уайат.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
New Zealand White Rabbits | Covance | - | |
HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
175 cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
Hyclone L-glutamine, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
DMSO | Sigma | 472301 | |
Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
Methanol | Sigma | 34860 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
- Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
- Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
- Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
- Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
- Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
- Able, S. L., et al. Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat. Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
- Via, L. E., et al. Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates. Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).
- Kalvass, J. C., Maurer, T. S. Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery. Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).
- Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).
- Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).