Метод «все на кристалле» для быстрого анализа хемотаксиса нейтрофилов непосредственно из капли крови
Summary
В этой статье представлен подробный метод проведения быстрого анализа хемотаксиса нейтрофилов путем интеграции изоляции нейтрофилов на кристалле из цельной крови и теста на хемотаксис на одном микрожидкостном чипе.
Abstract
Нейтрофильная миграция и хемотаксис являются критическими для иммунной системы нашего организма. Микрофлюидные устройства все чаще используются для исследования миграции нейтрофилов и хемотаксиса из-за их преимуществ в визуализации в реальном времени, точного контроля образования градиента концентрации химических веществ и снижения потребления реагентов и проб. В последнее время микрофлюидные исследователи предпринимают все более активные усилия по разработке интегрированных и легко управляемых систем микрофлюидного хемотаксиса непосредственно из цельной крови. В этом направлении был разработан первый метод «все на кристалле» для интеграции магнитной отрицательной очистки нейтрофилов и анализа хемотаксиса с образцами небольших объемов крови. Этот новый метод позволяет быстро провести анализ хемотаксиса нейтрофилов с образцом к результату через 25 мин. В этой статье мы предлагаем подробный метод построения, эксплуатации и анализа данных для этого анализа хемотаксиса на чипе с обсуждением стратегий устранения неисправностей, limiИ будущие направления. Показаны репрезентативные результаты анализа хемотаксиса нейтрофилов, в которых анализируется определенный хемоаттрактант, N- Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) и мокрота у пациента с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) с использованием этого метода «все на кристалле». Этот метод применим ко многим исследованиям, связанным с миграцией клеток и клиническим применениям.
Introduction
Хемотаксис, процесс направленной миграции клеток в растворимый градиент концентрации химических веществ, критически участвует во многих биологических процессах, включая иммунный ответ 1 , 2 , 3 , развитие тканей 4 и метастазы рака 5 . Нейтрофилы являются наиболее распространенным подсемейством лейкоцитов и играют решающую роль в обеспечении врожденных функций защиты организма в целом, а также в опосредовании адаптивных иммунных реакций 6 , 7 . Нейтрофилы снабжены высокорегулируемым хемотаксическим механизмом, позволяющим этим подвижным иммунным клеткам реагировать как на хемоаттрактанты, вызванные патогеном ( например, fMLP), так и на хетоаттрактанты хозяина ( например, интерлейкин-8) через хемотаксис 8 . Нейтрофильная миграция и хемотаксис опосредуют различные физиологические проблемыИ такие заболевания, как воспаление и рак 1 , 9 . Таким образом, точная оценка хемотаксиса нейтрофилов является важным функциональным показанием для изучения биологии нейтрофилов и связанных с ними заболеваний.
По сравнению с широко используемыми традиционными методами хемотаксиса ( например, анализ трансмуазы 10 ) микрофлюидные устройства демонстрируют большие перспективы для количественной оценки миграции клеток и хемотаксиса благодаря точно контролируемой генерации химического градиента и миниатюризации 11 , 12 , 13 . В течение последних двух десятилетий или около того были разработаны различные микрожидкостные устройства для изучения хемотаксиса различных типов биологических клеток, особенно нейтрофилов 11 . Значительные усилия были посвящены характеристике миграции нейтрофилов в пространственно-временном комплексе че Которые были сконфигурированы в микрожидкостных устройствах 14 , 15 . Были также разработаны интересные стратегии для изучения направленного принятия решений нейтрофилами с использованием микрожидкостных устройств 16. Помимо исследований, основанных на биологических исследованиях, применение микрожидкостных устройств было расширено для тестирования клинических образцов для оценки состояния 17 , 18 , 19 . Однако использование многих микрожидкостных устройств ограничено специализированными исследовательскими лабораториями и требует длительной изоляции нейтрофилов от большого объема образцов крови. Таким образом, наблюдается растущая тенденция разработки интегрированных микрожидкостных устройств для быстрого анализа хемотаксиса нейтрофилов непосредственно из капли цельной крови 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .
В этом направлении был разработан метод «все на кристалле», который объединяет магнитную отрицательную очистку нейтрофилов и последующий анализ хемотаксиса на одном микрожидкостном устройстве 25 . Этот метод «все на кристалле» имеет следующие новые особенности: 1) в отличие от предыдущих стратегий на чипе, которые изолируют нейтрофилы от крови путем адгезионной фиксации клеток или фильтрации на основе клеток 20 , 22 , этот новый метод позволяет Чистота, магнитное разделение нейтрофилов на кристалле от небольших объемов цельной крови, а также измерение хемотаксиса при стимуляции хемоаттрактанта; 2) структура док-станции ячейки позволяет выровнять начальные положения нейтрофилов близко к каналу химического градиента и позволяет провести простой анализ хемотаксиса без одноцелевого отслеживания; 3) интеграция изоляции нейтрофилов и хемотовОсевой анализ на одном микрожидкостном устройстве позволяет проводить быстрый анализ хемотаксиса с результатом до 25 мин, когда нет прерывания между экспериментальными стадиями.
В настоящем документе представлен подробный протокол для метода построения, эксплуатации и анализа данных этого хемотаксиса на основе кристаллов. В статье показано эффективное использование разработанного метода для проведения нейтрофильного хемотаксиса путем тестирования известного рекомбинантного хемоаттрактанта и сложных хемотактических образцов у пациентов, а затем обсуждение стратегий устранения неполадок, ограничений и будущих направлений.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье был описан подробный протокол для непосредственного выделения нейтрофилов из цельной крови, за которым следует тест хемотаксиса, все на одном микрожидкостном чипе. Этот метод предлагает полезные функции в его простой работе, отрицательный отбор высокочистых нейтрофило?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддерживается грантами из Совета по исследованиям естественных наук и инженерных исследований Канады (NSERC) и Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR). Мы благодарим Клинический институт прикладных исследований и образования в Большом госпитале Виктории в Виннипеге и Госпитале Семь Оукс в Виннипеге для управления клиническими образцами от людей. Мы благодарим доктора Хагита Переца-Сороку за полезную дискуссию о стратегиях операции анализа. Мы благодарим профессора Каролин Рен и доктора Сяоминя (Коди) Чена из Университета Ватерлоо за их щедрую поддержку в процессе съемок.
Materials
| Device fabrication | |||
| Mask aligner | ABM | N/A | |
| Spinner | Solitec | 5000 | |
| Hotplate | VWR | 11301-022 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Vacuum dessicator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Digital scale | Ohaus | CS200 | |
| SU-8 2000 thinner | Microchem | SU-8 2000 | |
| SU-8 2025 photoresist | Microchem | SU-8 2025 | |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 developer | |
| Si wafer | Silicon, Inc | LG2065 | |
| isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ellsworth Adhesives | 2065622 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Cutting pad | N/A | N/A | Custom-made |
| Punchers | N/A | N/A | Custom-made |
| Name | Source | Catalog Number | Comments |
| On-chip cell isolation and chemotaxis assay | |||
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH3025502 | |
| DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Bovine serum albumin (BSA) |
Sigma-Aldrich | SH3057402 | |
| Fibronectin | VWR | CACB356008 | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| Magnetic disks | Indigo Instruments | 44202-1 | 5 mm in diameter, 1 mm thick |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD10S | |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich |
R4127-5G | |
| Giemsa stain solution | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit |
STEMCELL Technologies Inc |
19666 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope | Nikon | Ti-U | |
| Microscope environmental chamber. | InVivo Scientific | N/A | |
| CCD camera | Nikon | DS-Fi1 |
References
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
- Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
- Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
- Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
- Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
- Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
- Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
- Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
- Sackmann, E. K. -. H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
- Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient’s sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).
