Un metodo integrato per l'analisi della chimotassi rapida dei neutrofili direttamente da una goccia di sangue
Summary
Questo articolo fornisce il metodo dettagliato per eseguire un rapido dosaggio della chemotaxis neutrofile integrando l'isolamento neutrofilo a circuito integrato dal sangue intero e il test di chemotaxis su un singolo chip microfluidico.
Abstract
La migrazione di neutrofili e la chemiotassi sono fondamentali per il sistema immunitario del nostro corpo. I dispositivi microfluidici sono sempre più utilizzati per indagare la migrazione dei neutrofili e la chemiotassi a causa dei loro vantaggi nella visualizzazione in tempo reale, controllo preciso della generazione di gradiente di concentrazione chimica e riduzione del reagente e del consumo di campioni. Recentemente, i ricercatori microfluidici hanno intrapreso uno sforzo crescente verso lo sviluppo di sistemi di analisi chimotassi microfluidici integrati e facili da usare, direttamente dal sangue intero. In questa direzione, è stato sviluppato il primo metodo integrale per integrare la purificazione neutra magnetica dei neutrofili e il test di chemotaxis da campioni di piccole quantità di sangue. Questo nuovo metodo consente una rapida prova chimotassi neutrofila del campione per risultato in 25 min. In questo documento, forniamo metodi dettagliati per la costruzione, l'operazione e l'analisi dei dati per questo test di chimotaxis a chip completo con una discussione sulle strategie di risoluzione dei problemi, limiLe direzioni future. Sono mostrati i risultati rappresentativi del test di neutotossido neutrofile che hanno dimostrato un esperto di chemoattractant, N -Formil-Met-Leu-Phe (fMLP) e l'espettorato di un paziente con malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD) utilizzando questo metodo su tutti i chip. Questo metodo è applicabile a molte ricerche correlate alla migrazione cellulare e alle applicazioni cliniche.
Introduction
Chemotaxis, un processo di migrazione diretta delle cellule a gradiente di concentrazione chimica solubile, è criticamente coinvolto in molti processi biologici, tra cui la risposta immunitaria 1 , 2 , 3 , lo sviluppo del tessuto 4 e la metastasi del cancro 5 . Neutrofili sono il più ricco sottocategoria delle cellule del sangue bianco e svolgono un ruolo cruciale nel permettere le funzioni di difesa innata dell'organismo del corpo, nonché nel mediare le risposte immunitarie adattative 6 , 7 . Neutrofili sono dotati di macchine chemotattiche altamente regolamentate che consentono a queste cellule immunitarie motile di rispondere sia a chemoattractants derivanti da patogeni ( ad es. FMLP) che ai chemoattractants derivanti da host ( ad esempio, interleukin-8) throughchemotaxis 8 . La migrazione di neutrofili e la chemiotassi mediano vari problemi fisiologiciE malattie come infiammazione e tumori 1 , 9 . Pertanto, la valutazione accurata della chemotaxide dei neutrofili fornisce una lettura funzionale importante per lo studio della biologia dei neutrofili e delle malattie associate.
Rispetto ai campioni di chimotaxis tradizionali ( es. Test di transwell 10 ), i dispositivi microfluidici mostrano grande promessa per la valutazione quantitativa della migrazione cellulare e della chemiotassi a causa della generazione chimica precisa e della miniaturizzazione dei gradienti 11 , 12 e 13 . Negli ultimi due decenni o giù di lì, sono stati sviluppati diversi dispositivi microfluidici per studiare la chemotaxia di diversi tipi di cellule biologiche, in particolare neutrofili 11 . Uno sforzo significativo è stato dedicato a caratterizzare la migrazione di neutrofili in un complesso spatiotemporalmente complesso Gradienti micali configurati nei dispositivi microfluidici 14 , 15 . Sono state sviluppate anche strategie interessanti per studiare decisioni direzionali da parte dei neutrofili usando i dispositivi microfluidici 16. All'interno della ricerca biologica, le applicazioni dei dispositivi microfluidici sono state estese per testare campioni clinici per la valutazione delle malattie 17 , 18 e 19 . Tuttavia, l'uso di molti dispositivi microfluidici è limitato a laboratori di ricerca specializzati e richiede un lungo isolamento dei neutrofili da un ampio volume di campioni di sangue. Pertanto, vi è stato un trend crescente di sviluppo di dispositivi microfluidici integrati per l'analisi rapida della chimotassi neutrofila direttamente da una goccia di sangue intero 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .
Verso questa direzione, è stato sviluppato un metodo integrale che integra la depurazione neutrofila negativa magnetica e il successivo dosaggio della chemotaxis su un unico dispositivo microfluidico 25 . Questo metodo a tutto vantaggio del chip ha le seguenti caratteristiche: 1) in contrasto con le strategie precedenti su chip che isolano neutrofili dal sangue mediante bloccaggio delle cellule adesione o filtri basati sulla dimensione cellulare 20 , 22 , questo nuovo metodo consente elevati La purezza, la separazione magnetica su chip dei neutrofili da piccoli volumi di sangue intero, nonché la misurazione della chemotaxia sulla stimolazione del chemoattractant; 2) la struttura di ancoraggio delle cellule aiuta a allineare le posizioni iniziali dei neutrofili vicino al canale di gradiente chimico e consente un'analisi semplice di chemiotassi senza tracciamento di singole celle; 3) l'integrazione dell'isolamento neutrofilo e del chemotL'analisi dell'asse su un unico dispositivo microfluidico consente un'analisi rapida del chimotassi da campione a risultato in 25 minuti quando non vi è interruzione tra i passaggi sperimentali.
Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per la costruzione, l'operazione e il metodo di analisi dei dati di questo test di chimotassi su tutti i chip. La carta dimostra l'efficace utilizzo del metodo sviluppato per l'esecuzione della chemotaxide dei neutrofili mediante la sperimentazione di un esperto chemoattractant ricombinante e campioni chemotattici complessi dai pazienti, seguito da una discussione sulle strategie di risoluzione dei problemi, le limitazioni e le direzioni future.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, è stato descritto un protocollo dettagliato per isolare direttamente neutrofili dal sangue intero seguito dal test di chemotaxis, tutti su un singolo chip microfluidico. Questo metodo offre funzionalità utili nel suo facile utilizzo, selezione negativa di neutrofili ad alta purezza, test rapido di chimotaxis da campione a risultato, reagenti ridotti e consumo di campioni e analisi accurate di dati di migrazione delle cellule. Come una stima approssimativa, almeno il 25% dei neutrofili dal campione …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è in parte sostenuto da sovvenzioni del Consiglio scientifico delle scienze naturali e ingegneria del Canada (NSERC) e dell'Istituto canadese di ricerca sulla salute (CIHR). Ringraziamo l'Istituto Clinico per la Ricerca Applicata e l'Educazione presso l'Ospedale Generale Victoria di Winnipeg e il Sette Oaks General Hospital di Winnipeg per la gestione di campioni clinici da soggetti umani. Ringraziamo il dottor Hagit Peretz-Soroka per una utile discussione sulle strategie di funzionamento del dosaggio. Ringraziamo il professor Carolyn Ren e il dottor Xiaoming (Cody) Chen dell'università di Waterloo per il loro generoso sostegno nel processo di ripresa.
Materials
| Device fabrication | |||
| Mask aligner | ABM | N/A | |
| Spinner | Solitec | 5000 | |
| Hotplate | VWR | 11301-022 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Vacuum dessicator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Digital scale | Ohaus | CS200 | |
| SU-8 2000 thinner | Microchem | SU-8 2000 | |
| SU-8 2025 photoresist | Microchem | SU-8 2025 | |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 developer | |
| Si wafer | Silicon, Inc | LG2065 | |
| isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ellsworth Adhesives | 2065622 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Cutting pad | N/A | N/A | Custom-made |
| Punchers | N/A | N/A | Custom-made |
| Name | Source | Catalog Number | Comments |
| On-chip cell isolation and chemotaxis assay | |||
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH3025502 | |
| DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Bovine serum albumin (BSA) |
Sigma-Aldrich | SH3057402 | |
| Fibronectin | VWR | CACB356008 | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| Magnetic disks | Indigo Instruments | 44202-1 | 5 mm in diameter, 1 mm thick |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD10S | |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich |
R4127-5G | |
| Giemsa stain solution | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit |
STEMCELL Technologies Inc |
19666 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope | Nikon | Ti-U | |
| Microscope environmental chamber. | InVivo Scientific | N/A | |
| CCD camera | Nikon | DS-Fi1 |
References
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