Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue
Summary
Este artigo fornece o método detalhado de realização de um teste rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando o isolamento de neutrófilos no chip do sangue total e o teste de quimiotaxia em um único microfluídico.
Abstract
A migração de neutrófilos e a quimiotaxia são críticas para o sistema imunológico do nosso corpo. Os dispositivos microfluídicos são cada vez mais utilizados para investigar a migração de neutrófilos e a quimiotaxia devido às suas vantagens na visualização em tempo real, controle preciso da geração de gradiente de concentração química e menor consumo de reagentes e amostras. Recentemente, um esforço crescente foi feito pelos pesquisadores microfluídicos para o desenvolvimento de sistemas de análise de quimiotaxia microfluídica integrada e de fácil operação, diretamente do sangue total. Nessa direção, o primeiro método all-on-chip foi desenvolvido para integrar a purificação magnética negativa de neutrófilos e o teste de quimiotaxia a partir de pequenas amostras de volume sanguíneo. Este novo método permite um rápido teste de quimiotaxia de neutrófilos de amostra a resultado em 25 min. Neste artigo, fornecemos métodos detalhados de construção, operação e análise de dados para este ensaio de quimiotaxia com todas as discussões sobre estratégias de solução de problemas, limiTations e direções futuras. Os resultados representativos do ensaio de quimiotaxia de neutrófilos com teste de um quimioatractante definido, N -Formulídeo-Met-Leu-Phe (fMLP) e escarro de um paciente com doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), usando este método de todo o chip. Este método é aplicável a muitas investigações relacionadas com migração celular e aplicações clínicas.
Introduction
A quimiotaxia, um processo de migração de células direcionadas para gradiente de concentração química solúvel, é criticamente envolvida em muitos processos biológicos, incluindo resposta imune 1 , 2 , 3 , desenvolvimento de tecido 4 e metástase de câncer 5 . Os neutrófilos são o subconjunto mais abundante de glóbulos brancos e desempenham papéis cruciais na habilitação das funções de defesa do hospedeiro inatas do corpo, bem como na mediação das respostas imunes adaptativas 6 , 7 . Os neutrófilos estão equipados com maquinaria quimiotáctica altamente regulada, permitindo que essas células imunes móveis respondam tanto a quimiotratantes derivados de patógenos ( por exemplo, fMLP) como a quimiotractivos derivados do hospedeiro ( por exemplo, interleucina-8) através de quimioestamento 8 . A migração de neutrófilos e a quimiotaxia medem vários problemas fisiológicosE doenças como inflamação e câncer 1 , 9 . Assim, a avaliação precisa da quimiotaxia dos neutrófilos fornece uma leitura funcional importante para estudar a biologia dos neutrófilos e as doenças associadas.
Em comparação com os ensaios de quimiotexia convencional amplamente utilizados ( por exemplo, o ensaio Transwell 10 ), os dispositivos microfluídicos são de grande promessa para a avaliação quantitativa da migração celular e da quimiotaxia devido à geração de gradiente químico e miniaturização com precisão 11 , 12 , 13 . Nas últimas duas décadas, vários dispositivos microfluídicos foram desenvolvidos para estudar a quimiotaxia de diferentes tipos de células biológicas, especialmente neutrófilos 11 . Um esforço significativo foi dedicado a caracterizar a migração de neutrófilos no complexo spatiotemporalmente complexo. Gradientes micos que foram configurados nos dispositivos microfluidicos 14 , 15 . Estratégias interessantes também foram desenvolvidas para estudar a tomada de decisão direcional por neutrófilos usando os dispositivos microfluídicos 16. A partir de pesquisas orientadas biologicamente, as aplicações de dispositivos microfluídicos foram estendidas para testar amostras clínicas para avaliação de doenças 17 , 18 , 19 . No entanto, o uso de muitos dispositivos microfluídicos é limitado a laboratórios especializados de pesquisa e exige um isolamento prolongado de neutrófilos a partir de grandes quantidades de amostras de sangue. Portanto, tem havido uma tendência crescente de desenvolvimento de dispositivos microfluídicos integrados para análise rápida de quimiotaxia de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue total 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .
Em direção a esta direção, desenvolveu-se um método todo-on-chip que integra a purificação de neutrófilos negativos magnéticos eo subsequente teste de quimiotaxia em um único dispositivo microfluídico 25 . Este método tudo-em-chip tem os seguintes recursos inovadores: 1) em contraste com as estratégias anteriores sobre o chip que isolam os neutrófilos do sangue por captura de células à base de adesão ou filtragem baseada em tamanho celular 20 , 22 , este novo método permite alta Pureza, separação magnética no chip dos neutrófilos de pequenos volumes de sangue total, bem como medição de quimiotaxia na estimulação quimiotratante; 2) a estrutura de encaixe da célula ajuda a alinhar as posições iniciais dos neutrófilos perto do canal de gradiente químico e permite análise de quimiotexia simples sem rastreamento celular único; 3) a integração do isolamento de neutrófilos e quimioterapiaO ensaio de eixo em um único dispositivo microfluídico permite uma rápida análise de quimiotaxia de amostra a resultado em 25 min quando não há interrupção entre etapas experimentais.
Este artigo fornece um protocolo detalhado para o método de construção, operação e análise de dados deste ensaio de quimiotaxia todo-em-chip. O documento demonstra o uso efetivo do método desenvolvido para realizar a quimiotaxia de neutrófilos, testando amostras chemoatractantes recombinantes recombinantes conhecidas e amostras chemotacticas complexas de pacientes, seguidas de uma discussão sobre estratégias de solução de problemas, limitações e direções futuras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho, foi descrito um protocolo detalhado para isolar diretamente os neutrófilos do sangue total seguido do teste de quimiotaxia, tudo em um único microfluídico. Este método oferece recursos úteis em sua operação fácil, seleção negativa de neutrófilos de alta pureza, teste de quimiotaxia rápido de amostra a resultado, reagentes reduzidos e consumo de amostras e análise precisa de dados de migração celular. Como uma estimativa aproximada, pelo menos 25% dos neutrófilos da amostra de sangue total…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é parcialmente apoiado por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (CRSNG) e os Institutos de Pesquisa em Saúde do Canadá (IRSC). Agradecemos ao Instituto Clínico de Pesquisa Aplicada e Educação no Hospital Geral de Victoria em Winnipeg e ao Hospital Geral Seven Oaks em Winnipeg para o gerenciamento de amostras clínicas de indivíduos humanos. Agradecemos ao Dr. Hagit Peretz-Soroka por uma discussão útil sobre as estratégias de operação do ensaio. Agradecemos a professora Carolyn Ren e Dr. Xiaoming (Cody) Chen da Universidade de Waterloo por seu generoso apoio no processo de filmagem.
Materials
| Device fabrication | |||
| Mask aligner | ABM | N/A | |
| Spinner | Solitec | 5000 | |
| Hotplate | VWR | 11301-022 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Vacuum dessicator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Digital scale | Ohaus | CS200 | |
| SU-8 2000 thinner | Microchem | SU-8 2000 | |
| SU-8 2025 photoresist | Microchem | SU-8 2025 | |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 developer | |
| Si wafer | Silicon, Inc | LG2065 | |
| isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ellsworth Adhesives | 2065622 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Cutting pad | N/A | N/A | Custom-made |
| Punchers | N/A | N/A | Custom-made |
| Name | Source | Catalog Number | Comments |
| On-chip cell isolation and chemotaxis assay | |||
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH3025502 | |
| DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Bovine serum albumin (BSA) |
Sigma-Aldrich | SH3057402 | |
| Fibronectin | VWR | CACB356008 | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| Magnetic disks | Indigo Instruments | 44202-1 | 5 mm in diameter, 1 mm thick |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD10S | |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich |
R4127-5G | |
| Giemsa stain solution | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit |
STEMCELL Technologies Inc |
19666 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope | Nikon | Ti-U | |
| Microscope environmental chamber. | InVivo Scientific | N/A | |
| CCD camera | Nikon | DS-Fi1 |
References
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