פתחנו שיטה חדשנית במיקרוסקופ אלקטרונים, "פלאש-ו-הקפאה," המאפשרת ויזואליזציה של דינמיקה הממברנה עם רזולוצית ms זמנית. טכניקה זו משלבת את גירוי optogenetic של נוירונים עם מקפיא בלחץ גבוה. הנה, אנחנו מדגימים את הנהלים לתאר את הפרוטוקולים בפירוט.
שנת תאי אדריכלות הקרום והפצת חלבון שלהם כל זמן, אבל זה מאוד קשה לדמיין את האירועים האלה ברזולוציה של זמן ומרחב על סדר ms ו ננומטר, בהתאמה. פיתחנו טכניקה מיקרוסקופית אלקטרונים זמן לפתור, "פלאש-ו-הקפאה," כי גורם אירועים הסלולר עם optogenetics ו 'ממחיש את הדינמיקה הקרום המתקבל על ידי הקפאת תאים בנקודות זמן מוגדר לאחר גירוי. כדי להדגים את הטכניקה הזו, הבענו channelrhodopsin, ערוץ קטיון רגיש לאור, ב נוירונים בהיפוקמפוס העכבר. בזק של אור מגרת פעילות עצבית וגורם לשחרור הנוירוטרנסמיטר ממסופי הסינפטי באמצעות השילוב של שלפוחית סינפטית. גירוי optogenetic של נוירונים מצמיד עם מקפיא בלחץ גבוה כדי לעקוב אחרי שינויים מורפולוגיים במהלך שידור סינפטי. באמצעות מכשיר מסחרי, אנו כבשנו את השילוב של שלפוחית סינפטית וההתאוששות של synaקרום שלפוחית ptic. כדי להמחיש את השתלשלות האירועים, מערכי נתונים גדולים נוצרו וניתח באופן עיוור, שכן שינויים מורפולוגיים לוו בתאים שונים לאורך זמן. אף על פי כן, פלאש-ו-הקפאה מאפשרת ההדמיה של דינמיקת הממברנה ב micrographs אלקטרונים עם רזולוצית ms זמנית.
חזותי קרום וחלבון דינמיקה בתוך תא הוא צעד מפתח להבנת הביולוגיה של התא של תהליכים מסוימים. אירועי סחר דינמי ניתן ללכוד באמצעות מיקרוסקופ אור או פלואורסצנטי. עם זאת, בהקשר התת-תאי חסר בעיקר בתמונות מסוג זה משום מבני subcellular לא ניתן לחלוטין "צבוע" על ידי צבעים או בדיקות ניאון ו נפתרו מרחבית 1 ספקטרלית, 2. מצד השני, בעוד במיקרוסקופ אלקטרונים יכול להתוות ארכיטקטורה התת-תאי בפירוט יוצא דופן, זה לא יכול ללכוד דינמיקת סלולר, כי דגימות חייבות להיות קבועה לפני ההדמיה. לכן, זה בדרך כלל לא מספיק כדי להבין את הדינמיקה הסלולר לחלוטין באמצעות שיטת הדמיה יחידה.
כדי להתגבר על המגבלות של אור במיקרוסקופ אלקטרונים, שיטות מיקרוסקופיה המצטרף פותחו. אור הקורלטיבי במיקרוסקופ אלקטרונים(קלם) מדמיין דינמיקה תאית באמצעות מיקרוסקופ אור ומבנים התת-תאי בסיסיים עם מיקרוסקופ אלקטרונים. בשנת קלם, תאים עוסקים בתהליכים שונים, כגון cytokinesis ו אנדוציטוזה 3, 4, 5, 6, הם חיות-צלם ולאחר מכן מעובד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים. למרות קלם לוכד היבטים מסוימים של דינמיקה תאית, ישנם ארבעה גורמים המגבילים את התועלת של גישה זו. ראשית, ההחלטה הזמנית מוגבלת על ידי כמה יכול להיות משותקת התאים במהירות, אשר בדרך כלל לוקח שניות – דקות עקב דיפוזיה התגובה האיטית של fixatives 7. שנית, את ארכיטקטורת subcellular שנצפתה בדיעבד 8; לפיכך, השינויים מורפולוגיים הדינמיים לא ניתן ללכוד באמצעות גישה זו. שלישית, micrographs פלואורסצנטי אלקטרונים לא ניתן להתאים אותה בדיוק בגלל sh רקמותrinkage שנגרם על ידי התייבשות במהלך הכנת המדגם עבור במיקרוסקופ אלקטרונים 9, 10. הרביעית, אירועים כמו cytokinesis ו אנדוציטוזה אינם מתרחשים בעת ובעונה אחת בכל תא 5, 11, ובכך, תא מסוים עוסק האירוע חייב להיות מזוהה מאוכלוסייה גדולה של תאים. תהליך זה הוא לעתים קרובות מייגע. לפיכך, שיטה חדשה יש צורך לגרום לאירועים בפרט בכל תא כדי ללכוד את דינמיקת הסלולר וכתוצאה ידי הקיבוע המהיר של תאים בנקודות זמן מוגדרים.
לאחרונה, מספר כלים פותחו כדי לגרום דינמיקה סלולר מסוימת באמצעות אור (optogenetics). Channelrhodopsin הוא ערוץ קטיון רגיש לאור, הלא סלקטיבי מבודד Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. כאשר channelrhodopsin מתבטאת neuronaממברנות l, הבהוב קל של אור מעורר זרם של יוני נתרן לתוך הנוירונים מפעיל פעולה 14 פוטנציאל, 15. פוטנציאל הפעולה ואז מתפשט לתוך מסופי הסינפטי, שבו שלפוחית סינפטית פתיל בתוך אלפיות 16, 17, 18 לכן, channelrhodopsin גורם פעילות עצבית. כדי לעקוב אחרי דינמיקת קרום במסופים הסינפטי, נוירונים חייב להיות משותק בנקודות זמן מוגדרות לאחר גירוי עם דיוק ms.
כדי ללכוד דינמיקת קרום לאחר גרימת פעילות עצבית, אנו מצמידים גירוי אור עם בלחץ גבוה מקפיא 17, 18, 19. הקפאה בלחץ גבוה מאפשר קיבוע כמעט מיידי של תאים עם היווצרות קרח קריסטל מופחת 20. גבישי קרח can להתפקע ממברנות ולשבש את הארכיטקטורה subcellular 21. על ידי שינוי מרווחי הזמן בין הגירוי והקפאה, סחר קרום בתוך מסופי הסינפטי נתפס בעקבות אינדוקציה של פוטנציאל פעולה.
הנה, אנחנו מדגימים פרוצדורות באמצעות הקפאה בלחץ גבוה ממוסחרת כי זוגות שליטת ms זמנית של גירוי אור עם מקפיא בלחץ גבוה. בשונה מכשירים אחרים שדורשים בהתקן חיצוני כדי לשלוט גירוי אור והקפאה, גירוי אור משולב במלואו במערכת זו והוא יכול להיות מיושם עם דיוק ms 19. תהליך זה כרוך שלבים מרובים. 1) נוירונים בהיפוקמפוס עכבר מתורבתים על דיסקים ספיר נגוע lentivirus נושאת וקטור ביטוי עבור channelrhodopsin 18. 2) נוירונים הם מגורה קפוא בנקודות זמן מוגדרות לאחר גירוי. 3) המים המזוגגים הוא תחליףד עם ממס אורגני, ואילו שומנים וחלבונים הם צולבים ידי fixatives לשמר את הארכיטקטורה התאית. 4) הדגימות הם הסתננו ומוטבעי שרף אפוקסי. 5) סעיפים Ultrathin נאספים באמצעות ultramicrotome. 6) סעיפים Thin הם צילמו על מיקרוסקופ אלקטרונים חודרת. 7) תמונת רכישה וניתוח מבוצעים באופן עיוור לגבי נקודות זמן או גנוטיפים. דינמיקה סלולר ניתן לקבוע באמצעות שחזור של תמונות הזמן נפתר 17, 18. הכנת דוגמאות (שלבים 2 – 5 לעיל) מחייב שבוע, אך בניתוח התמונה העוקב דורש חודשים עד שנה.
גישת "פלאש-ו-ההקפאה" מדמיין דינמיקת קרום ידי גרימת אירוע הסלולר בפרט עם optogenetics ועל ידי הקפאת תאים בנקודות זמן מוגדרת לאחר גירוי 19. בהפגנה זו, השתמשנו channelrhodopsin, ערוץ קטיון רגיש לאור, כדי לעורר נוירונים וכבשנו את ההיתוך והתאוששות של שלפוחית סינפטית במסופי הסינפטי. בשנים האחרונות, כלי optogenetic רבים פותחו 22, 23, שכולן עולים בקנה אחד עם פלאש-ו-הקפאה. לדוגמה, סחר אברון יכול להיגרם באמצעות heterodimerization המושרה-לאור קריפטוכרום ו CIB1 24. בדומה לכך, הרכב השומנים של קרום התא ניתן לשנות על ידי טרנסלוקציה אור המושרה של phosphatases phosphoinositide קרום הפלזמה 25. יתר על כן, קטנות, רגישות לאור תרכובות כמו azobenzene chקונפורמציה Ange תלוי באורכי גל תאורה. ניתן להשתמש זה שינוי קונפורמציה להפעיל ערוצים מגודרים ליגנד או לשנות רכב שומנים בקרום 26, 27. תרכובות בכלוב יכול לשמש גם כדי לגרום פעילות הסלולר. עם זאת, ה- LED המשמשים את ההתקנה הנוכחית לא יכול לייצר מספיק אנרגיה עבור משחררות רפרוף; וכך, אופטימיזציות נוספות של המערכת נחוצות סביר. עם זאת, היישומים של כלי אור-activatable אלה הם אירועים הסלולר גמישים-רבים יכולים להיגרם על ידי בזק של אור. "פלאש-ו-הקפאה" יכול ללכוד את הדינמיקה הקרום המתקבל.
ישנן שתי מגבלות עיקריות לשיטת "פלאש-ו-ההקפאה". ראשית, היא לוכדת "תמונות" של אירוע מסוים מתאים שונים. במילים אחרות, לא ניתן לעקוב הדינמיקה הממברנה בתא אחד על פני תקופה של זמן. לפיכך, לבנייה מחדש של כל הסלולר אפילוt, אחד חייב לרכוש ולנתח מספר רב של תמונות מכל מדגם ו בכל נקודת זמן. יתר על כן, בנוירונים, למספר גדול אף יותר של תמונות יש צורך, שכן שילוב של שלפוחית סינפטית לוקח רק במקומות 20 – 30% של סינפסות ב נוירונים בהיפוקמפוס עכבר 18, 28. הניתוח של נתונים כזה גדול דורש כמויות עצומות של זמן. בעתיד, רכישת תמונה וניתוח צריכים להיות אוטומטית על מנת להפוך את הגישה יעילה יותר 29, 30.
המגבלה השנייה היא שהטיל הטבע של טכניקת ההקפאה בלחץ גבוה. כאשר תאים להקפיא, מים הסלולר מארגנים מחדש כדי ליצור גבישי קרח אם שיעור המקפיא הוא מתחת 100 K / s 21. גבישי קרח אלו יכולים לחדור ממברנות או להתרכז מומס לשנות לחץ האוסמוטי מקומי, וכתוצאה מכך פקיעת קרומים. כדי למנוע גבישי קרח, בפולחץ h (~ 2000 ATM) מוחל על דגימות. בשל אפקט הקירור-העל, שיעור מקפיא של 100 K / s מספיק כדי למנוע מהמים ויוצרים גבישי קרח על הלחץ הזה 21. בתיאוריה, דגימות עבה כמו 500 מיקרומטר אפשר להקפיא בלי גבישי קרח, אבל כ 200 מיקרומטר צפוי הגבול המעשי, כמו צורות cuboidal קרח נוטים להיווצר רקמה עבה, להתפשר מורפולוגיה. כאשר עיבוד הדגימות עבות יותר 5 מיקרומטר, השימוש קריו-מגן ראוי, כגון BSA, יש צורך. עם זאת, BSA ישנה את osmolarity של הפתרון ועשוי להשפיע על התגובה הפיזיולוגית של תאים. לכן, ניסויים שליטה נרחבת נדרשים כדי לאמת את השימוש BSA במערכות בפרט. גבישי קרח יכול להיווצר גם לאחר הקפאה בלחץ גבוה אם דגימות מוסרים בטעות מן האמבט חנקן נוזלי. לכן, חשוב לשמור על הדגימות של החנקן הנוזלי בכל העת להשתמש במלקחיים טרום מקורריםלתפעל אותם.
כאשר מתכננים ניסויים, שלוש הנקודות הבאות צריכות להיחשב. ראשית, העוצמת המקסימלי של אור (460 קו ננומטר) היא 5.5 – 8.0 mW / מ"מ 2. אם האינטנסיביות הזו מספיקה כדי לגרום פעילות יש לוודא עם דימות תאים חיים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני ניסויים-ו-להקפיא פלאש. שנית, יש לבצע ניסויים בטמפרטורה פיזיולוגית. השלב מהמקפיא בלחץ גבוה מחומם עד 37 ° C עבור ניסויים עם נוירונים בהיפוקמפוס עכבר 31. לבסוף, בנקודות הזמן חייבות להיות שנבחרו בקפידה על מנת ללכוד את הדינמיקה הממברנה. מחקרים ראשוניים מציינים כי אנדוציטוזה תושלם לאחר 100 ms של גירוי. לפיכך, שלוש נקודות זמן נוסף (15, 30, 50 & ms) נבדקו גם כדי לעקוב אחר הדינמיקה קרום 17, 18. נקודות הזמן הללו היו דרושות כדי לחזות באירוע סחר קרוםים במהלך שידור סינפטי. עם זאת, הדרישה עבור מספר נקודות זמן שונה בכל אירוע הסלולר. לכן, כמה נקודות זמן צריכות להיות שנדגמו לפני ביצוע איסוף במערך גדול.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מאוניברסיטת ג'ונס הופקינס (SW). אנו מודים ספר ג'ונס הופקינס של מתקן מיקרוסקופ לרפואה לתמיכה הטכנית שלהם. אנו מודים אריק יורגנסן ונוצרים Rosenmund וחברי המעבדות שלהם לפיתוח הטכניקה. אנו מודים M. ווין דייוויס עבור העיצוב של המכשיר הראשוני. אנו מודים פול Wurzinger, Cveta Tomova, ו Delgermaa Luvsanjav לקבלת הסיוע הטכני שלהם. אנו מודים גם נטלי ר המילטון ו גרנט פ Kusick לקריאה ביקורתית שלהם של כתב היד.
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
Whatman I filter paper | GE | ||
Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |