Biz msn zamansal çözünürlüğe sahip membran dinamiklerinin görüntülenmesini sağlayarak elektron mikroskobu, "flaş-and-donması" içinde yeni bir teknik geliştirdi. Bu teknik, yüksek basınçlı dondurma nöron Optogenetic uyarılmasını birleştirir. Burada, prosedürleri göstermek ve ayrıntılı protokolleri açıklar.
Hücreler sürekli zar mimarisini ve protein dağılımı değiştirmek, ancak sırasıyla ms ve nm sipariş üzerine zamansal ve uzamsal çözünürlükte bu olayları görselleştirmek için son derece zordur. Biz optogenetics ile hücresel olayları neden ve stimülasyon sonrasında belirli zaman aralıklarıyla hücrelerini dondurarak çıkan zar dinamiklerini görselleştiren bir zaman çözümlü elektron mikroskobu tekniği, "flaş-and-donması" geliştirdik. Bu teknik göstermek için, fare hipokampal nöronlar channelrhodopsin, ışığa duyarlı bir katyon kanalı olarak ifade edilmiştir. Bir ışık flaş nöronal etkinliği artırır ve sinaptik veziküllerin füzyon yoluyla sinaptik terminallerinden nörotransmitter salımını indükler. nöronların Optogenetic uyarılması sinaptik iletim sırasındaki morfolojik değişiklikleri takip etmek için yüksek basınçlı dondurma ile birleştirilir. Ticari bir enstrüman kullanarak, sinaptik veziküllerin füzyon ve Syna kurtarılmasını yakalananptic vezikül membranı. olaylar dizisi görselleştirmek için, büyük veri setleri üretilmiş ve morfolojik değişiklikler, zaman içinde farklı hücrelerde takip edildi çünkü, kör analiz edilmiştir. Bununla birlikte, flash ve dondurma msn zamansal çözünürlüğe sahip elektron mikrografiklerinde membran dinamikleri görselleştirme sağlar.
bir hücre içinde membran ve protein dinamikleri görselleştirme belirli işlemlerin hücre biyolojisi anlama yolunda önemli bir adımdır. Dinamik trafik olayları açık veya floresan mikroskobu kullanarak yakalanabilir. Hücre alt yapıları tamamen boyalar veya floresan prob tarafından "boyalı" ve mekansal olarak çözümlenmiş ve spektral olarak 1, 2 edilemez Ancak, hücre altı bağlam büyük ölçüde bu tür görüntülerde eksik. elektron mikroskobu en ince ayrıntısına kadar hücre altı mimarisini tasvir edebilir ederken örnekler görüntüleme öncesi düzeltilmesi gerekir çünkü Öte yandan, bu, hücresel dinamiklerini yakalamak olamaz. Böylece, tamamen tek bir görüntüleme tarzı kullanılarak hücresel dinamiklerini anlamak için genellikle yeterli değildir.
ışık ve elektron mikroskobu sınırlamaları aşmak için, bağıntılı mikroskopi teknikleri geliştirilmiştir. Korelatif Işık ve Elektron Mikroskopi(CLEM) ışık mikroskopisi ve elektron mikroskopi ile altta yatan hücre içi yapıları kullanılarak hücre içi dinamikleri görselleştirir. Clem, bu tür sitokinez ve endositoz 3, 4, 5, 6 gibi çeşitli işlemlerle, yapan hücrelerin, canlı görüntülenmiş ve daha sonra, elektron mikroskopi için işlemden geçirilir. CLEM hücre içi dinamikleri bazı yönlerini yakalar, bu yaklaşımın faydasını sınırlamak dört faktör vardır. Min nedeniyle yavaş difüzyonu ve fiksatifler 7 reaksiyona – İlk olarak, zamansal çözünürlüğe hücreleri tipik s alır, immobilize edilebilir ne kadar hızlı ile sınırlıdır. İkinci olarak, hücre içi mimari görülmektedir post facto 8; Böylece, dinamik morfolojik değişiklikler bu yaklaşımı kullanılarak çekilen edilemez. Üçüncü olarak, floresans ve elektron mikrografları tam doku sh nedeniyle nmayabilirElektron mikroskobu 9, 10, örnek hazırlama sırasında dehidrasyon neden rinkage. Dördüncüsü, sitokinez ve endositoz gibi olaylar her hücrede 5, 11 aynı anda yer almayan ve bu nedenle, olayın yapan belirli bir hücre hücrelerinin büyük bir nüfustan tanımlanmalıdır. Bu süreç genellikle zahmetli bir iştir. Bu durumda, yeni bir yöntem, her hücrede belirli olayların uyarılmasına ve belirlenen zaman noktalarında hücrelerin hızlı immobilizasyon ile elde edilen selüler dinamiklerini gereklidir.
Son zamanlarda, çeşitli araçlar ışık (optogenetics) kullanılarak belirli hücresel dinamikleri ikna etmek geliştirilmiştir. Channelrhodopsin 13, 12 reinhardtii Chlamydomonas izole edilen bir ışığa duyarlı, seçici olmayan bir katyon kanaldır. channelrhodopsin Neurona eksprese edildiğindelitre membran, bir ışık kısa flaş nöronlara sodyum iyonlarının akışını indükler ve 14, 15, potansiyel bir işlem tetikler. Aksiyon potansiyeli daha sonra sinaptik veziküllerin 18 Bu nedenle, channelrhodopsin nöronal aktivitenin neden milisaniye 16, 17 içinde sigorta sinaptik terminallerinden içine yayar. sinaptik terminallerindeki membran dinamikleri takip etmek için, nöronların ms hassasiyetle stimülasyon sonrasında belirli zaman aralıklarıyla hareketsiz olmalıdır.
Nöronal aktiviteyi uyaran sonra membran dinamikleri elde etmek için, yüksek basınç 17, 18, 19 ve donan hafif uyarılması bağlanmıştır. Yüksek basınçlı dondurma düşük bir buz kristali oluşumu 20 olan hücrelerin neredeyse anlık immobilizasyon için izin verir. Buz kristalleri can zarları ve hücre altı mimariyi 21 bozabilir. uyarılması ve dondurma arasındaki zaman aralıklarını değiştirerek, sinaptik terminallerinden içinde membran trafik aksiyon potansiyelinin indüksiyonundan sonra yakalandı.
Burada, bu çiftler, yüksek basınçlı dondurma hafif bir uyarım ms zamansal kontrol bir ticari yüksek basınçlı dondurucu kullanılarak, deneysel prosedürler göstermektedir. Işık uyarılması ve donma kontrolü için bir dış aygıt gerektiren diğer araçlar farklı olarak, ışık uyarımı bu sistemde tam entegre ve MS hassas 19 ile uygulanabilir. Bu süreç birden adımdan oluşur. 1) fare hipokampal nöronlar safir diskler üzerinde kültüre ve lentivirüs channelrhodopsin 18 için bir ifade vektörünü taşıyan bulaştırılır. 2) Nöronlar uyarılır ve stimülasyon sonrasında belirli zaman aralıklarıyla dondurulur. 3) vitrifiye su yerine geçerorganik bir çözücü ile d, lipitler ve proteinler ise hücreler arası mimari korumak için fiksatif tarafından çapraz bağlanmalıdır. 4) Numuneleri infiltre ve epoksi reçine içine gömülü olan. 5) ince kesitler ultramikrotom kullanılarak toplanır. 6) ince kesitler bir transmisyon elektron mikroskobu ile görüntülenmiş. 7) Görüntü edinimi ve analiz süresi noktaları veya genotipler ile ilgili körlemesine gerçekleştirilmiştir. Hücresel dinamikleri zaman çözümlemeli görüntülerin 17, 18 yeniden inşası yoluyla belirlenebilir. Bir hafta gerektirir, ancak daha sonraki görüntü analizi bir yıl aylar gerektirir – Numune Hazırlama (yukarıdaki 5 2. adımları).
"Flaş ve dondurma" yaklaşımı optogenetics ile belirli bir hücre etkinliği uyararak ve stimülasyon 19 sonra belirli zaman hücreler dondurma ile membran dinamikleri görselleştirir. Bu gösteri, nöronlar teşvik etmek için, channelrhodopsin, ışığa duyarlı bir katyon kanal için ve sinaptik terminallerindeki füzyon ve sinaptik veziküllerin kurtarma ele. Son yıllarda, birçok Optogenetic araçları flaş-and-dondurma ile uyumlu olan, her biri 22, 23, geliştirilmiştir. Örneğin, organel trafik Kriptokrom'un ve CIB1 24 ışık kaynaklı heterodimerizasyonu kullanılarak indüklenebilir. Benzer bir şekilde, plazma membran lipid kompozisyonu, plazma membranı 25 fosfoinositid fosfatazların ışık kaynaklı translokasyonu ile değiştirilebilir. Bundan başka, azobenzen ch gibi küçük, ışığa duyarlı bileşiklerinaydınlatma dalga boylarında bağlı ange konformasyon. Bu konformasyonal değişiklik ligand kapılı kanalları etkinleştirmek veya zar 26, 27 lipid kompozisyonu değiştirmek için kullanılabilir. Kafesli bileşimler de hücresel aktiviteyi artırdığı için kullanılabilir. Bununla birlikte, mevcut kurulumunda kullanılan LED uncaging için yeterli bir enerji oluşturacak olmayabilir; Bu şekilde, sistemin daha iyi duruma muhtemelen gereklidir. Bununla birlikte, bu ışık ile aktive edilebilen araçları uygulamaları esnek birçok hücresel olaylar bir flaş ışığına karşı indüklenebilir bulunmaktadır. "Flash ve dondurma" Ortaya çıkan zar dinamiklerini yakalayabilir.
"Flash ve dondurma" yöntemine iki ana sınırlamalar vardır. Birincisi, farklı hücrelerden belirli bir olayın "anlık" yakalar. Başka bir deyişle, belirli bir süre boyunca tek hücrede membran dinamikleri takip etmek mümkün değildir. Bu durumda, herhangi bir hücresel rekonstrüksiyonu için bilet, alınan ve her bir örnekten ve her bir zaman noktasında bir görüntü sayıda analiz gerekir. Fare hipokampal nöronlar 18, 28 sinapsların% 30 – sinaptik veziküllerin füzyon sadece 20 içinde yer alır Bundan başka, nöronlarda, görüntülerin daha da büyük bir sayı, gereklidir. Böyle büyük bir veri kümesi analizi zaman büyük miktarda gerektirir. Gelecekte, görüntü toplama ve analiz 29, 30 yaklaşım daha verimli kılmak için otomatik gerekmektedir.
İkinci bir kısıtlama yüksek basınçlı dondurma tekniği doğası tarafından uygulanır. Hücreler donduğunda hücresel suyun donma hızı 100 K / s 21 altında ise buz kristalleri meydana getirmek üzere yeniden düzenlenir. Bu buz kristalleri zarlarına nüfuz ya da membran yırtılması ile sonuçlanır yerel ozmotik basıncı değiştirmek için çözünmüş konsantre olabilir. Buz kristalleri önlemek için, HIGh basıncı (~ 2.000 atm) numuneler uygulanır. Nedeniyle, süper-soğutma etkisi, 100 K / s'lik bir dondurma oranı, bu basınç 21 buz kristallerinin oluşturulması su önlemek için yeterlidir. Teorik olarak, 500 um buz kristalleri olmadan dondurulabilir ancak buz küp şeklindeki formları kalın dokuda oluşturma eğiliminde olarak yaklaşık 200 um morfolojisi ödün, muhtemelen pratik sınırı kadar kalın ve numune. işlem daha kalın 5 um ve numune zaman, BSA gibi uygun bir kriyo-koruyucu maddenin kullanımı gereklidir. Bununla birlikte, BSA çözeltisi ozmolaritesini değişecek ve hücrelerin fizyolojik yanıtı etkileyebilir. Bu nedenle, geniş bir kontrol deneyleri özel sistemler BSA kullanımını geçerli kılmak için gerekmektedir. Numuneler kazara sıvı azot banyosu kaldırılır ise buz kristalleri yüksek basınç dondurulmasından sonra meydana gelebilir. Bu nedenle, her zaman sıvı azot içinde örnekleri tutmak için ve önceden soğutulmuş forseps kullanımı kritiktirOnları manipüle.
deneyler planlarken, aşağıdaki üç puan düşünülmelidir. 8,0 mW / mm2 – İlk olarak, ışığın maksimum yoğunluğu (460 nm hattı) 5.5. Bu yoğunluk aktiviteyi teşvik etmek için yeterli olup olmadığı flash ve dondurucu deneyler öncesinde bir floresan mikroskop üzerinde canlı hücre görüntüleme ile doğrulanması gerekir. İkinci olarak, deneyler, fizyolojik sıcaklıkta gerçekleştirilmelidir. Yüksek basınçlı dondurucunun aşamada fare hipokampal nöronlar 31 deney boyunca 37 ° C 'ye kadar ısıtılır. Son olarak, zaman noktaları dikkatle membran dinamiklerini yakalamak için seçilmelidir. İlk çalışmalar endositoz uyarımı 100 ms sonra tam olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, üç ek zaman noktaları (15, 30, 50 ms) aynı zamanda membran dinamikleri 17, 18 takip etmek için incelenmiştir. Bu zaman noktaları membran kaçakçılığı olayı görselleştirmek için gerekliydisinaptik iletimi sırasında s. Ancak, zaman noktalarının sayısı için gereksinim her hücresel olay farklıdır. Bu nedenle, birkaç zaman noktaları büyük veri kümesi koleksiyonunu başlamadan önce örneklenmiş edilmelidir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Johns Hopkins Üniversitesi (GB) fon tarafından desteklenmiştir. Biz onların teknik destek için Tıp Mikroskop Tesisi Johns Hopkins Okulu teşekkür ederim. Biz tekniğin geliştirilmesi için Erik Jorgensen ve Christian Rosenmund ve laboratuarlar üyelerine teşekkür. Biz ilk cihazın tasarımı için M. Wayne Davis teşekkür ederim. Biz onların teknik yardım için Paul Wurzinger, Cveta Tomova ve Delgermaa Luvsanjav teşekkür ederim. Ayrıca yazının eleştirel okuma Natalie R. Hamilton ve Grant F. Kusick teşekkür ederim.
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
Whatman I filter paper | GE | ||
Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |