Hemos desarrollado una nueva técnica de microscopía electrónica, "Flash-y-congelación", que permite la visualización de la dinámica de la membrana con ms resolución temporal. Esta técnica combina la estimulación optogenético de neuronas con la congelación de alta presión. Aquí, demostramos los procedimientos y describimos los protocolos en detalle.
Las células cambian constantemente su arquitectura membrana y distribución de las proteínas, pero es extremadamente difícil de visualizar estos eventos a una resolución temporal y espacial del orden de ms y nm, respectivamente. Hemos desarrollado una técnica resuelta en el tiempo microscopía electrónica, "flash-y-congelación", que induce eventos celulares con optogenética y visualiza la dinámica membrana resultante mediante la congelación de las células en los puntos de tiempo definidos después de la estimulación. Para demostrar esta técnica, expresamos canalrodopsina, un canal catiónico sensible a la luz, en las neuronas del hipocampo del ratón. Un destello de luz estimula la actividad neuronal e induce la liberación de neurotransmisores desde las terminales sinápticas a través de la fusión de las vesículas sinápticas. La estimulación de las neuronas optogenético se acopla con la congelación de alta presión para seguir los cambios morfológicos durante la transmisión sináptica. El uso de un instrumento comercial, capturamos la fusión de las vesículas sinápticas y la recuperación de la synamembrana de la vesícula PTIC. Para visualizar la secuencia de eventos, grandes conjuntos de datos se generaron y analizaron a ciegas, ya que los cambios morfológicos fueron seguidos en diferentes células en el tiempo. Sin embargo, flash-y-congelación permite la visualización de dinámica de la membrana en las micrografías electrónicas con resolución temporal ms.
Visualización dinámica de la membrana y proteínas dentro de una célula es un paso clave hacia la comprensión de la biología celular de procesos particulares. eventos de tráfico dinámico se pueden capturar usando la luz o microscopía de fluorescencia. Sin embargo, el contexto subcelular está en gran parte ausente en este tipo de imágenes porque las estructuras subcelulares no puede ser completamente "pintadas" por colorantes o sondas fluorescentes y resueltas espacialmente y espectralmente 1, 2. Por otro lado, si bien la microscopía electrónica puede delinear la arquitectura subcelular con exquisito detalle, no puede capturar la dinámica celular, ya que las muestras deben fijarse antes de la imagen. Así, es típicamente no es suficiente para entender completamente la dinámica celular usando solamente una modalidad de imagen.
Para superar las limitaciones de la luz y microscopía electrónica, se han desarrollado técnicas de microscopía correlativos. Correlativa de luz y microscopía electrónica(CLEM) visualiza dinámica intracelular utilizando microscopía de luz y estructuras subcelulares subyacentes con microscopía electrónica. En CLEM, las células que participan en varios procesos, tales como la citocinesis y la endocitosis 3, 4, 5, 6, son-live imagen y luego procesados para microscopía electrónica. Aunque CLEM captura ciertos aspectos de la dinámica intracelulares, hay cuatro factores que limitan la utilidad de este enfoque. En primer lugar, la resolución temporal está limitada por la rapidez con la que las células pueden inmovilizarse, que típicamente toma s – min debido a la lenta difusión y la reacción de fijadores 7. En segundo lugar, se observa la arquitectura subcelular post facto 8; Por lo tanto, los cambios morfológicos dinámicas no pueden ser capturados utilizando este enfoque. En tercer lugar, las micrografías de fluorescencia y de electrones no se pueden alinear con precisión debido a sh tejidorinkage causada por la deshidratación durante la preparación de la muestra para microscopía electrónica 9, 10. En cuarto lugar, eventos como la citocinesis y la endocitosis no tienen lugar al mismo tiempo en todas las células 5, 11, y por lo tanto, una célula particular que se dedica en caso deben ser identificados a partir de una gran población de células. Este proceso es a menudo laborioso. Por lo tanto, un nuevo método es necesaria para inducir eventos particulares en cada célula y para capturar la dinámica celular resultantes por la rápida inmovilización de células en puntos de tiempo definidos.
Recientemente, varios se han desarrollado herramientas para inducir particulares dinámica celular utilizando la luz (optogenética). Canalrodopsina es un canal de catión sensible a la luz, no selectivo aislado de Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Cuando se expresa en canalrodopsina neuronal membranas, un breve destello de luz induce una afluencia de iones de sodio en neuronas y desencadena una acción potencial 14, 15. El potencial de acción se propaga entonces en los terminales sinápticos, donde las vesículas sinápticas se fusionan en cuestión de milisegundos 16, 17, 18 Por lo tanto, canalrodopsina induce la actividad neuronal. Para seguir dinámica de la membrana en las terminales sinápticas, las neuronas deben ser inmovilizados en puntos de tiempo definidos después de la estimulación con precisión ms.
Para capturar dinámica de la membrana después de la inducción de la actividad neuronal, que acoplamos la estimulación de luz con alta presión de congelación 17, 18, 19. Congelación de alta presión permite la inmovilización casi instantánea de las células con la formación de cristales de hielo reducida 20. Los cristales de hielo can romper las membranas y perturbar la arquitectura subcelular 21. Variando los intervalos de tiempo entre la estimulación y la congelación, el tráfico de membrana dentro de los terminales sinápticos fue capturado después de la inducción de un potencial de acción.
Aquí, demostramos procedimientos experimentales usando un congelador de alta presión comercializado que las parejas un control temporal ms de estimulación de la luz con la congelación de alta presión. A diferencia de otros instrumentos que requieren un dispositivo externo para controlar la estimulación de luz y la congelación, la estimulación de luz está totalmente integrado en este sistema y se puede aplicar con precisión ms 19. Este proceso implica varios pasos. 1) las neuronas del hipocampo de ratón se cultivan en discos de zafiro e infectadas con lentivirus que lleva un vector de expresión para canalrodopsina 18. 2) Las neuronas son estimuladas y se congelaron a puntos de tiempo definidos después de la estimulación. 3) El agua vitrificada es sustitutod con un disolvente orgánico, mientras que los lípidos y las proteínas son reticulados por fijadores para preservar la arquitectura intracelular. 4) Las muestras se infiltraron y embebidos en resina epoxi. 5) secciones ultrafinas se recogen usando un ultramicrotomo. 6) Las secciones finas se forman imágenes en un microscopio electrónico de transmisión. 7) de adquisición y análisis de imágenes se llevan a cabo a ciegas con respecto a los puntos de tiempo o genotipos. La dinámica celular se pueden determinar a través de la reconstrucción de imágenes con resolución temporal 17, 18. Preparación de la muestra (pasos 2 – 5 más arriba) requiere una semana, pero el análisis de la imagen subsiguiente requiere meses a un año.
El enfoque de "flash-y-congelación" visualiza dinámica de la membrana mediante la inducción de un evento celular particular con la optogenética y mediante la congelación de las células en los puntos de tiempo definidos después de la estimulación 19. En esta demostración, se utilizó canalrodopsina, un canal catiónico sensible a la luz, para estimular las neuronas y capturó la fusión y la recuperación de las vesículas sinápticas en los terminales sinápticas. En los últimos años, muchas herramientas optogenéticos se han desarrollado 22, 23, todos los cuales son compatibles con flash-y-congelación. Por ejemplo, el tráfico de orgánulo puede ser inducida mediante heterodimerización inducida por la luz de criptocromo y CIB1 24. Del mismo modo, la composición lipídica de la membrana plasmática puede ser alterado por la translocación inducida por la luz de las fosfatasas phosphoinositide a la membrana plasmática 25. Además, pequeñas, compuestos sensibles a la luz como ch azobencenoconformación ange dependiendo de las longitudes de onda de iluminación. Este cambio conformacional se puede utilizar para activar los canales activados por ligando o para cambiar la composición de lípidos en la membrana 26, 27. compuestos enjaulados también se pueden utilizar para inducir la actividad celular. Sin embargo, el LED se utiliza en la configuración actual no puede producir suficiente energía para uncaging; Por lo tanto, otras optimizaciones del sistema son probablemente necesario. Sin embargo, las aplicaciones de estas herramientas activable por luz son eventos celulares flexibles-muchos pueden ser inducidas por un destello de luz. "Flash-y-congelación" puede capturar la dinámica de membrana resultantes.
Hay dos principales limitaciones para el método de "destello y congelación". En primer lugar, se capta "instantáneas" de un evento en particular de diferentes células. En otras palabras, no es posible seguir la dinámica de la membrana en una celda durante un período de tiempo. Por lo tanto, para la reconstrucción de cualquier celular, inclusot, uno debe adquirir y analizar un gran número de imágenes de cada muestra y en cada punto de tiempo. Además, en las neuronas, un número aún mayor de las imágenes es necesario, ya que la fusión de las vesículas sinápticas solamente tiene lugar en 20 – 30% de las sinapsis en las neuronas del hipocampo del ratón 18, 28. El análisis de un gran conjunto de datos de este tipo requiere enormes cantidades de tiempo. En el futuro, la adquisición y análisis de imágenes necesitan ser automatizado para hacer el enfoque más eficiente 29, 30.
La segunda limitación es impuesta por la naturaleza de la técnica de congelación de alta presión. Cuando las células se congelan, agua celular reorganiza para formar cristales de hielo si la velocidad de congelación es inferior a 100 K / s 21. Estos cristales de hielo pueden penetrar en las membranas o concentrarse solutos para alterar la presión osmótica local, dando como resultado la rotura de las membranas. Para evitar los cristales de hielo, high presión (~ 2,000 atm) se aplica a los especímenes. Debido al efecto de super-enfriamiento, una velocidad de congelación de 100 K / s es suficiente para evitar que el agua de formación de cristales de hielo a esta presión 21. En teoría, especímenes tan gruesa como de 500 micras se pueden congelar sin cristales de hielo, pero aproximadamente 200 micras es probable el límite práctico, como formas cúbicas de hielo tienden a formar en el tejido de espesor, comprometiendo la morfología. Cuando el procesamiento de muestras más gruesas que 5 m, el uso de un crio-protector adecuado, tal como BSA, es necesario. Sin embargo, BSA va a cambiar la osmolaridad de la solución y puede afectar la respuesta fisiológica de las células. Por lo tanto, se requieren extensos experimentos de control para validar el uso de BSA en sistemas particulares. Los cristales de hielo también se pueden formar después de la congelación de alta presión si los especímenes se retiran accidentalmente desde el baño de nitrógeno líquido. Por lo tanto, es crítico para mantener los especímenes en el nitrógeno líquido en todo momento y para el uso de fórceps preenfriado amanipularlos.
Cuando la planificación de experimentos, los tres puntos siguientes deben ser considerados. En primer lugar, la intensidad máxima de la luz (la línea de 460 nm) es 5,5 a 8,0 mW / mm 2. Si esta intensidad es suficiente para inducir la actividad debe ser verificado con imágenes de células vivas en un microscopio de fluorescencia antes de los experimentos de inflamación y liofiliza. En segundo lugar, los experimentos deben realizarse a temperatura fisiológica. La etapa del congelador de alta presión se calienta hasta 37 ° C para los experimentos con las neuronas del hipocampo del ratón 31. Por último, los puntos de tiempo deben ser elegidos cuidadosamente para capturar la dinámica de la membrana. Los estudios iniciales indicaron que la endocitosis es completa después de 100 ms de estimulación. Por lo tanto, los tres puntos de tiempo adicionales (15, 30, y 50 ms) también fueron examinados para seguir la dinámica de la membrana 17, 18. Estos puntos de tiempo fueron necesarios para visualizar caso el tráfico de membranas durante la transmisión sináptica. Sin embargo, el requisito para el número de puntos de tiempo son diferentes en cada evento celular. Por lo tanto, algunos puntos de tiempo deben ser muestreados antes de iniciar la recogida de datos de gran tamaño.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por fondos de la Johns Hopkins University (SW). Agradecemos a la Escuela Johns Hopkins de instalación de medicina microscopio por su apoyo técnico. Agradecemos a Erik Jorgensen y Christian Rosenmund y los miembros de sus laboratorios para el desarrollo de la técnica. Agradecemos a M. Wayne Davis para el diseño del dispositivo inicial. Agradecemos a Paul Wurzinger, Cveta Tomova y Delgermaa Luvsanjav por su asistencia técnica. Agradecemos también a Natalie R. Hamilton y Grant F. Kusick para su lectura crítica del manuscrito.
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
Whatman I filter paper | GE | ||
Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |