Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Co-Lokalisierung zwischen Komponenten von Gap, Tight und Adherens Junctions in Murine Mamma Drüsen
Summary
Interzelluläre Übergänge sind Requisiten für Brustdrüsen-Bühnenspezifische Funktionen und Entwicklung. Dieses Manuskript liefert ein detailliertes Protokoll für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) und Co-Lokalisierung mit Hilfe von murinen Brustdrüsen. Diese Techniken erlauben die Untersuchung der Dynamik der physikalischen Assoziation zwischen interzellulären Übergängen in verschiedenen Entwicklungsstadien.
Abstract
Zell-Zell-Interaktionen spielen eine zentrale Rolle bei der Erhaltung der Gewebeintegrität und der Barriere zwischen den verschiedenen Kompartimenten der Brustdrüse. Diese Wechselwirkungen werden durch junctionale Proteine bereitgestellt, die Nexus zwischen benachbarten Zellen bilden. Junctional Protein-Mislocalisierung und reduzierte physikalische Assoziationen mit ihren Bindungspartnern können zum Verlust der Funktion und damit zur Organ-Dysfunktion führen. Somit ist die Identifizierung von Proteinlokalisierung und Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) in normalen und krankheitsbezogenen Geweben unerlässlich, um neue Beweise und Mechanismen zu finden, die zum Fortschreiten von Krankheiten oder Veränderungen im Entwicklungsstatus führen. Dieses Manuskript stellt eine zweistufige Methode zur Beurteilung von PPIs in murinen Brustdrüsen dar. Im Protokollabschnitt 1 wird ein Verfahren zur Durchführung von Co-Immunfluoreszenz (Co-IF) unter Verwendung von Antikörpern, die gegen die interessierenden Proteine angehoben werden, gefolgt von sekundären Antikörpern, die mit Fluorochromen markiert sind, beschrieben. Obwohl Co-IF alleOws für die Demonstration der Nähe der Proteine, macht es möglich, ihre physikalischen Wechselwirkungen zu studieren. Daher wird im Protokollabschnitt 2 ein detailliertes Protokoll zur Co-Immunpräzipitation (Co-IP) bereitgestellt. Dieses Verfahren wird verwendet, um die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu bestimmen, ohne zu bestätigen, ob diese Wechselwirkungen direkt oder indirekt sind. In den letzten Jahren haben Co-IF- und Co-IP-Techniken gezeigt, dass bestimmte Komponenten von interzellulären Knotenpunkten zusammen lokalisieren und miteinander interagieren, wodurch stadienabhängige Junction-Nexusen entstehen, die während der Brustdrüsenentwicklung variieren.
Introduction
Mamma-Drüsenwachstum und -entwicklung erfolgt vor allem nach der Geburt. Dieses Organ umgibt sich ständig während des Fortpflanzungslebens eines Säugetiers 1 . Das erwachsene Brustdrüsenepithel besteht aus einer inneren Schicht von luminalen Epithelzellen und einer äußeren Schicht von Basalzellen, die hauptsächlich aus Myoepithelzellen besteht und von einer Basalmembran 2 umgeben ist. Für eine gute Übersicht über die Brustdrüsenstruktur und -entwicklung kann sich der Leser auf Sternlicht 1 beziehen. Für die normale Entwicklung und Funktion der Drüse 1 , 3 , 4 , 5 , 6 sind Zell-Zell-Wechselwirkungen über Lücke (GJ), enge (TJ) und Adhärens (AJ) -Knoten erforderlich. Die Hauptbestandteile dieser Übergänge in der Mäuse-Brustdrüse sind Cx26, Cx30, Cx32 und Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 und -7 undZO-1 (TJ); Und E-Cadherin, P-Cadherin und β-Catenin (AJ) 7 , 8 . Die Expressionsniveaus dieser verschiedenen junctionalen Proteine variieren in einer stadienabhängigen Weise während der Brustdrüsenentwicklung, was auf differentielle Zell-Zell-Interaktionsanforderungen hindeutet. GJ, TJ und AJ sind strukturell und funktionell verknüpft und fesseln andere strukturelle oder regulatorische Proteine an die benachbarten Stellen benachbarter Zellen und schaffen so einen Junction-Nexus 10 . Die Zusammensetzung des Junction-Nexus kann die Überbrückung mit dem darunter liegenden Zytoskelett sowie die Nexus-Permeabilität und -Stabilität beeinflussen und kann folglich die Funktion der Drüse 8 , 9 , 10 , 11 beeinflussen. Die Bestandteile von interzellulären Übergängen, die sich in junctionalen Nexusionen befinden oder miteinander in difDie Entwicklungsstadien der Entwicklung der Brustdrüsen wurden vor kurzem mit Co-Immunfluoreszenz (Co-IF) und Co-Immunpräzipitation (Co-IP) 9 analysiert. Während andere Techniken die Auswertung der funktionalen Assoziation zwischen Proteinen erlauben, werden diese Methoden in diesem Manuskript nicht dargestellt.
Da Proteine nur alleine funktionieren, ist das Studium von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs), wie Signaltransduktionen und biochemischen Kaskaden, für viele Forscher von wesentlicher Bedeutung und kann signifikante Informationen über die Funktion von Proteinen liefern. Co-IF und mikroskopische Analyse helfen, einige Proteine zu bewerten, die denselben subzellulären Raum teilen. Allerdings ist die Anzahl der Ziele durch die Antikörper begrenzt, die bei verschiedenen Tieren angehoben werden müssen, und durch den Zugang zu einem konfokalen Mikroskop, das mit verschiedenen Wellenlängenlasern und einem Spektraldetektor zum Multiplexen ausgestattet ist. Co-IP bestätigt oder zeigt hochaffine physikalische Wechselwirkungen zwischenZwei oder mehr Proteine, die sich innerhalb eines Proteinkomplexes befinden Trotz der Entwicklung neuartiger Techniken wie der Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragung (FRET) 12 und dem Proximity-Ligation Assay (PLA) 13 , die gleichzeitig die Lokalisierung und Interaktionen von Proteinen nachweisen können, bleibt Co-IP eine geeignete und erschwingliche Technik, um Wechselwirkungen zwischen ihnen zu untersuchen Endogene Proteine.
Die Schritt-für-Schritt-Methode, die in diesem Manuskript beschrieben wird, erleichtert das Studium der Proteinlokalisierung und der PPIs und weist auf Fallstricke hin, um beim Studium endogener PPIs in den Brustdrüsen zu vermeiden. Die Methodik beginnt mit der Präsentation der verschiedenen Konservierungsverfahren für die für jede Technik benötigten Gewebe. Teil 1 präsentiert, wie man die Protein-Co-Lokalisation in drei Schritten untersucht: i) die Sektion von Milchdrüsen, ii) die Doppel- oder Dreifachmarkierung verschiedener Proteine unter Verwendung der Co-IF-Technik und iii) die Abbildung vonProteinlokalisierung Teil 2 zeigt, wie man ein endogenes Protein ausfällt und seine interagierenden Proteine in drei Schritten identifiziert: i) Lysatpräparation, ii) indirekte Proteinimmunpräzipitation und iii) Bindungspartneridentifikation durch SDS-PAGE und Western Blot. Jeder Schritt dieses Protokolls ist für Nagetier-Brustdrüsengewebe optimiert und erzeugt qualitativ hochwertige, spezifische und reproduzierbare Ergebnisse. Dieses Protokoll kann auch als Ausgangspunkt für PPI-Studien in anderen Geweben oder Zelllinien verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zell-Zell-Interaktionen über Kreuzungen sind für die richtige Funktion und Entwicklung von vielen Organen, wie die Brustdrüse erforderlich. Studien haben gezeigt, dass junctionale Proteine die Funktion und Stabilität voneinander regulieren und die Signaltransduktion durch die Bindung an der Zellmembran 10 aktivieren können. Die Protokolle, die in der aktuellen Manuskript präsentiert wurden, haben interessante Ergebnisse über die junctionale Protein-Differential-Expression, Lokalisier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IP wird von einem Naturwissenschaften und Ingenieurwissenschaftsrat von Kanada finanziert (NSERC # 418233-2012); Ein Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), ein Trainerpreis der Quebec-Brustkrebs-Stiftung und ein Leader Founds-Stipendium der kanadischen Stiftung für Innovationsträger. ED erhielt ein Stipendium der Fondation universitaire Armand-Frappier.
Materials
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10X (stock) | 1) Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.4 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
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| TBS 10X (stock) | 1) Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.5 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1-Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Mentioned in Column D | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2-Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0 | 1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9) |
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| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Mentioned in coulmn D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
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