Murin Makat Boğazlarında Gap, Sıkı ve Aderans Bağlantılarının Bileşenleri Arasındaki Protein-Protein Etkileşimlerinin ve Ortak Lokalizasyon Analizleri
Summary
Hücre içi kavşak, meme bezi aşamasına özgü fonksiyonlar ve gelişim için şarttır. Bu el yazması, protein-protein etkileşimlerinin (PPI'lar) çalışılması ve murin meme bezlerinin birlikte lokalizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu teknikler, farklı gelişim evrelerinde hücre-içi kavşaklar arasındaki fiziksel ilişkinin dinamiklerinin araştırılmasına olanak tanır.
Abstract
Hücre-hücre etkileşimleri doku bütünlüğünü ve meme bezinin farklı bölmeleri arasındaki bariyerin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Bu etkileşimler, komşu hücreler arasında bağlar oluşturan bağlantılı proteinler tarafından sağlanmaktadır. Junctional protein mislokalizasyonu ve bağlanma partnerleriyle fiziksel birleşmelerin azalması, fonksiyon kaybına ve dolayısıyla organ işlev bozukluğuna neden olabilir. Bu nedenle, normal ve hastalıkla ilişkili dokulardaki protein lokalizasyonunu ve protein-protein etkileşimlerini (PPI'leri) tanımlamak, gelişme durumundaki hastalıkların veya değişikliklerin ilerlemesine yol açan yeni kanıt ve mekanizmalar bulmak için gereklidir. Bu el yazması, murin meme bezlerinde PPI'ları değerlendirmek için iki aşamalı bir yöntem sunmaktadır. Protokol bölüm 1'de, ilgilenilen proteinlere karşı geliştirilen antikorları, ardından florokromlarla etiketlenmiş ikincil antikorları kullanarak birlikte immünofloresans (co-IF) gerçekleştirmek için bir yöntem anlatılmıştır. Hep birlikte olsa daProteinlerin yakınlığının gösterilmesi için, fiziksel etkileşimlerini incelemeyi mümkün kılar. Bu nedenle, birlikte immüno çökelme (co-IP) için ayrıntılı bir protokol, protokol bölüm 2'de sağlanmaktadır. Bu yöntem, bu etkileşimlerin doğrudan veya dolaylı olup olmadığını teyit etmeden proteinler arasındaki fiziksel etkileşimleri belirlemek için kullanılır. Son birkaç yılda birlikte-IF ve birlikte IP teknikleri, hücrelerarası kavşaklardaki belirli bileşenlerin birlikte nöbetleşip birbirleriyle etkileşimde bulunduğunu ve meme bezi gelişiminde değişen aşamaya bağlı bileşke bağları oluşturduğunu göstermiştir.
Introduction
Meme bezi büyüme ve gelişme esas olarak doğumdan sonra gerçekleşir. Bu organ, bir memelinin üreme hayatında kendisini sürekli olarak yeniden şekillendirir 1 . Yetişkin meme bezi epitelyumu luminal epitelyal hücrelerin bir iç tabaka ve esasen miyoepitelyal hücrelerden oluşan, bazal membranla çevrili 2 bir bazal hücre tabakasından oluşur. Meme bezi yapısı ve gelişimiyle ilgili iyi bir inceleme için, okuyucu Sternlicht 1'e başvurabilir. Boşluk (GJ), sıkı (TJ) ve adherens (AJ) kavşakları yoluyla hücre-hücre etkileşimleri, bezin normal gelişimi ve fonksiyonu için 1 , 3 , 4 , 5 , 6 için gereklidir. Bu fare bağırsağındaki bu kavşakların ana bileşenleri Cx26, Cx30, Cx32 ve Cx43'tür (GJ); Claudin-1, -3, -4 ve -7 veZ0-1 (TJ); Ve E-cadherin, P-kadherin ve β-katenin (AJ) 7,8. Bu farklı jonksiyonel proteinlerin ekspresyon seviyeleri, meme bezi gelişimi esnasında aşamaya bağlı bir şekilde değişir ve farklı hücre-hücre etkileşim gereksinimlerini önermektedir 9 . GJ, TJ ve AJ yapısal ve işlevsel olarak birbirine bağlanır ve diğer yapısal veya düzenleyici proteinleri komşu hücrelere komşu bölgelere bağlarlar ve böylece bir bağlantılı bağ 10 oluştururlar. Bağlantılı bağın bileşimi, alttaki hücre iskeletiyle köprü oluşturmayı, ayrıca bağın geçirgenliğini ve stabilitesini etkileyebilir ve dolayısıyla bezin işlevini etkileyebilir 8 , 9 , 10 , 11 . Bileşik bağlarda bulunan veya diferansiyel olarak birbirleri ile etkileşen hücrelerarası kavşak bileşenleriMeme bezi gelişiminin gelişmekte olan aşamaları, yakın zamanda, birlikte immünfloresans (co-IF) ve birlikte immüno çöktürme (co-IP) 9 kullanılarak analiz edildi. Diğer teknikler, proteinler arasındaki fonksiyonel ilişkinin değerlendirilmesini sağlarken, bu metotlar bu elyazmasında sunulmamaktadır.
Proteinlerin sadece işlev için tek başına hareket etmesi nedeniyle, sinyal transdüksiyonları ve biyokimyasal kaskadlar gibi protein-protein etkileşimlerinin (PPI'lar) çalışılması birçok araştırmacı için çok önemlidir ve proteinlerin fonksiyonu hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Eş-IF ve mikroskobik analiz, aynı hücre altı alanı paylaşan birkaç proteinin değerlendirilmesine yardımcı olur. Bununla birlikte, hedeflerin sayısı, farklı hayvanlarda yetiştirilmesi gereken antikorlarla ve farklı dalga boylu lazerler ve çoklama için bir spektral dedektör ile donatılmış bir konfokal mikroskopa erişimle sınırlandırılmıştır. Co-IP, yüksek afiniteli fiziksel etkileşimleri teyit eder veya ortaya çıkarırBir protein kompleksinde bulunan iki veya daha fazla protein. Eşzamanlı olarak proteinlerin lokalizasyonunu ve etkileşimlerini saptayabilen floresans rezonans enerji transferi (FRET) 12 ve yakınlık ligasyonu deneyi (PLA) 13 gibi yeni teknikler geliştirilmesine rağmen, co-IP, arasındaki karşılıklı etkileşimleri incelemek için uygun ve uygun bir teknik olarak kalmaya devam etmektedir Endojen proteinler.
Bu el yazmasında anlatılan adım adım yöntem, protein lokalizasyonu ve ÜFE'lerin incelenmesini kolaylaştıracak ve meme bezlerinde endojen PPI'ları incelerken kaçınmak için tuzaklara işaret edecektir. Metodoloji, her bir teknik için gerekli olan dokular için farklı koruma prosedürlerinin sunulmasıyla başlar. Bölüm 1, üç aşamalı olarak protein ortak lokalizasyonu üzerinde çalışmayı göstermektedir: i) meme bezlerinin kesitlenmesi, ii) ko-IF tekniği kullanılarak farklı proteinlerin çift veya üçlü etiketlenmesi ve iii)Protein lokalizasyonu. Bölüm 2, endojen bir proteinin çökeltilmesi ve etkileşen proteinlerin üç aşamada nasıl belirleneceğini göstermektedir: i) lizat hazırlama, ii) dolaylı protein immunopresipitasyonu ve iii) SDS-PAGE ve Western blot ile partner tanımlamanın bağlanması. Bu protokolün her basamağı kemirgen meme bezi dokuları için optimize edilmiştir ve yüksek kaliteli, spesifik ve tekrarlanabilir sonuçlar üretir. Bu protokol, diğer dokulardaki veya hücre hatlarındaki PPI çalışmalarının başlangıç noktası olarak da kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bağırsak yoluyla hücre-hücre etkileşimleri, meme bezi gibi birçok organın düzgün işleyişi ve gelişimi için gereklidir. Araştırmalar junctional proteinlerin birbirlerinin işlev ve istikrarını düzenleyebildiğini ve sinyal iletimini hücre zarı 10'da birbirine bağlayarak aktive edebildiğini göstermiştir. Mevcut el yazmasında sunulan protokoller, normal fare bezi gelişiminde junctional protein diferansiyel ifadesi, lokalizasyonu ve etkileşimi hakkında ilginç bulgular…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IP, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmektedir (NSERC # 418233-2012); Bir Quebec Meme Kanseri Vakfı kariyer ödülü olan bir Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS) ve Canadian Foundation for Innovation hibe için bir Leader Founds yardımı. ED, Fondation universitaire Armand-Frappier'den bir burs aldı.
Materials
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10X (stock) | 1) Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.4 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| TBS 10X (stock) | 1) Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.5 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1-Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Mentioned in Column D | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2-Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0 | 1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Mentioned in coulmn D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
- Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
- Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
- Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
- Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
- Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
- Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
- Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
- Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
- Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).
