Анализ белково-белковых взаимодействий и ко-локализация между компонентами разрывов, затянутых и адгезивных соединений в молочных железах мышей
Summary
Межклеточные соединения являются реквизитами для специфических функций и развития молочной железы. В этой рукописи содержится подробный протокол изучения белково-белковых взаимодействий (ИЦП) и совместной локализации с использованием мышиных молочных желез. Эти методы позволяют исследовать динамику физической связи между межклеточными переходами на разных стадиях развития.
Abstract
Клеточные клетки играют ключевую роль в сохранении целостности тканей и барьера между различными отделениями молочной железы. Эти взаимодействия обеспечивают взаимодействующие белки, которые образуют нексусы между соседними клетками. Неправильная локализация белка и снижение физических ассоциаций с их партнерами по связыванию могут привести к потере функции и, следовательно, к дисфункции органов. Таким образом, идентификация локализации белка и белково-белковых взаимодействий (ИЦП) в нормальных и связанных с заболеванием тканях имеет важное значение для поиска новых доказательств и механизмов, ведущих к прогрессированию заболеваний или изменений в статусе развития. Эта рукопись представляет собой двухэтапный метод оценки ИПП в мышечных молочных железах. В разделе 1 протокола описывается способ проведения совместной иммунофлуоресценции (co-IF) с использованием антител, выращенных против представляющих интерес белков, с последующими вторичными антителами, меченными флуорохромами. Хотя со-IF всеДля демонстрации близости белков, это позволяет изучать их физические взаимодействия. Поэтому подробный протокол для совместного иммунопреципитации (со-IP) предоставляется в разделе 2 протокола. Этот метод используется для определения физических взаимодействий между белками, не подтверждая, являются ли эти взаимодействия прямыми или косвенными. В последние несколько лет методы совместного ИФ и со-IP продемонстрировали, что некоторые компоненты межклеточных соединений совместно локализуются и взаимодействуют друг с другом, создавая сценические взаимосвязи, которые изменяются в процессе развития молочной железы.
Introduction
Рост и развитие молочной железы происходит в основном после рождения. Этот орган постоянно реконструируется в течение всей репродуктивной жизни млекопитающего 1 . Эпителий молочной железы взрослых состоит из внутреннего слоя эпителиальных клеток просвета и внешнего слоя базальных клеток, в основном состоящих из миоэпителиальных клеток, окруженных подвальной мембраной 2 . Для хорошего обзора структуры и развития молочной железы читатель может обратиться к Sternlicht 1 . Для нормального развития и функции железы 1 , 3 , 4 , 5 , 6 необходимы клеточные взаимодействия через щелевые (GJ), тесные (TJ) и адгезивные (AJ) переходы. Основными компонентами этих соединений в мышечной молочной железе являются Cx26, Cx30, Cx32 и Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 и -7 иZO-1 (TJ); И E-кадгерин, P-кадгерин и β-катенин (AJ) 7,8 . Уровни экспрессии этих различных белков-мишеней изменяются в зависимости от стадии в процессе развития молочной железы, что предполагает дифференциальное взаимодействие клеток с клетками 9 . GJ, TJ и AJ связаны структурно и функционально и связывают другие структурные или регуляторные белки с соседними сайтами соседних клеток, создавая, таким образом, функциональную связь 10 . Состав соединительной связи может влиять на мостик с основным цитоскелетом, а также на проницаемость и стабильность связи и может, следовательно, влиять на функцию железы 8 , 9 , 10 , 11 . Компоненты межклеточных соединений, находящихся в узловых связях или взаимодействующих друг с другом при разныхНедавно были проанализированы первые стадии развития развития молочной железы с использованием совместной иммунофлуоресценции (co-IF) и совместного иммунопреципитации (со-IP) 9 . В то время как другие методы позволяют оценить функциональную связь между белками, эти методы не представлены в этой рукописи.
Поскольку белки действуют только один, чтобы работать, изучение белково-белковых взаимодействий (ИЦП), таких как трансдукция сигналов и биохимические каскады, важно для многих исследователей и может предоставить значительную информацию о функции белков. Co-IF и микроскопический анализ помогают оценить несколько белков, которые разделяют одно и то же субклеточное пространство. Однако количество мишеней ограничено антителами, которые должны быть выращены у разных животных, а также доступом к конфокальному микроскопу, оснащенному различными лазерными волнами длины и спектральным детектором для мультиплексирования. Co-IP подтверждает или показывает физическое взаимодействие с высоким сродством betwEen два или более белка, находящихся в белковом комплексе. Несмотря на разработку новых методов, таких как флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) 12 и анализ лигирования близости (PLA) 13 , который может одновременно обнаруживать локализацию и взаимодействие белков, со-IP остается подходящим и доступным методом для изучения взаимодействий между Эндогенных белков.
Пошаговый метод, описанный в этой рукописи, облегчит изучение локализации белка и ИЦП и укажет на ловушки, чтобы избежать изучения эндогенных ИЦП в молочных железах. Методология начинается с представления различных процедур консервации тканей, необходимых для каждого метода. В части 1 показано, как изучать совместную локализацию белка в три этапа: i) секционирование молочных желез, ii) двойную или тройную маркировку различных белков с использованием метода co-IF, и iii) визуализациюЛокализация белка. В части 2 показано, как осадить эндогенный белок и идентифицировать его взаимодействующие белки в три этапа: i) препарат лизата, ii) иммунопреципитацию непрямого белка и iii) идентификацию связывающего партнера с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга. Каждый шаг этого протокола оптимизирован для тканей молочной железы грызунов и генерирует высококачественные, специфичные и воспроизводимые результаты. Этот протокол также может быть использован в качестве отправной точки для исследований PPI в других тканях или клеточных линиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Клеточные клетки взаимодействий через соединения необходимы для правильной функции и развития многих органов, таких как молочная железа. Исследования показали, что функциональные белки могут регулировать функцию и стабильность друг друга и активировать передачу сигнала путем соеди…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ИС финансируется Советом по научным исследованиям в области естественных наук и инженерных исследований Канады (NSERC # 418233-2012); Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), карьера в области рака молочной железы в Квебеке и грант Лидера на получение гранта Канадского фонда поддержки инноваций. ED получил стипендию от Universidire Fandation Armand-Frappier.
Materials
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10X (stock) | 1) Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.4 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| TBS 10X (stock) | 1) Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.5 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1-Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Mentioned in Column D | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2-Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0 | 1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Mentioned in coulmn D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
- Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
- Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
- Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
- Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
- Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
- Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
- Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
- Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
- Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).
