Analyse van eiwit-eiwitinteracties en co-lokalisatie tussen componenten van kloof-, strakke- en adherentie-knooppunten in muizenmammarysklieren
Summary
Intercellulaire kruispunten zijn benodigdheden voor stadiumspecifieke functies en ontwikkeling van de borstklier. Dit manuscript biedt een gedetailleerd protocol voor de studie van eiwit-eiwit interacties (PPI's) en co-lokalisatie met behulp van muizenklinieken. Deze technieken maken het mogelijk om de dynamiek van de fysieke associatie tussen intercellulaire kruispunten in verschillende ontwikkelingsstadia te onderzoeken.
Abstract
Cell-cel interacties spelen een cruciale rol bij het behoud van de weefselintegriteit en de barrière tussen de verschillende compartimenten van de borstklier. Deze interacties worden geleverd door junctionele eiwitten die nexussen vormen tussen aangrenzende cellen. Junctionele eiwit mislokalisatie en verminderde fysieke associaties met hun bindende partners kunnen resulteren in verlies van functie en bijgevolg tot orgaansdisfunctie. Zo is het identificeren van eiwit lokalisatie en eiwit-eiwit interacties (PPI's) in normale en ziekteverwante weefsels essentieel om nieuwe bewijzen en mechanismen te vinden die leiden tot de voortgang van ziekten of veranderingen in ontwikkelingsstatus. Dit manuscript presenteert een tweetraps methode om PPI's in muizenkliere te beoordelen. In protocol sectie 1 wordt een werkwijze beschreven voor het uitvoeren van co-immunofluorescentie (co-IF) onder gebruikmaking van antilichamen die worden opgewekt tegen de eiwitten van belang, gevolgd door secundaire antilichamen die met fluorochromen gemerkt zijn. Hoewel co-IF allemaalOws voor de demonstratie van de nabijheid van de eiwitten, het maakt het mogelijk om hun fysieke interacties te bestuderen. Daarom wordt een gedetailleerd protocol voor co-immunoprecipitatie (co-IP) gegeven in protocol sectie 2. Deze methode wordt gebruikt om de fysieke interacties tussen eiwitten te bepalen, zonder te bevestigen of deze interacties direct of indirect zijn. In de laatste jaren hebben co-IF en co-IP technieken aangetoond dat bepaalde componenten van intercellulaire kruispunten co-lokaliseren en samenwerken, waardoor stadiumafhankelijke kruispunten ontstaan die variëren tijdens de ontwikkeling van de borstkanker.
Introduction
De groei en ontwikkeling van de mammierklier komt voornamelijk na de geboorte voor. Dit orgaan remodelleert zich voortdurend door het voortplantingsleven van een zoogdier 1 . Het volwassen embryonale epitheel bestaat uit een binnenlaag van luminale epitheelcellen en een buitenste laag basale cellen, voornamelijk samengesteld uit myoepitheliale cellen, omringd door een keldermembraan 2 . Voor een goede beoordeling over de structuur en ontwikkeling van de borstklier kan de lezer naar Sternlicht 1 verwijzen. Cell-cel interacties via gap (GJ), strak (TJ) en adheren (AJ) kruispunten zijn nodig voor de normale ontwikkeling en functie van de klier 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . De belangrijkste componenten van deze kruispunten in de muizenkliniek zijn Cx26, Cx30, Cx32 en Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 en -7 enZO-1 (TJ); En E-cadherine, P-cadherine, en β-catenin (AJ) 7 , 8 . De expressieniveaus van deze verschillende junctionele eiwitten variëren op een stadiumafhankelijke wijze tijdens de ontwikkeling van de borstkanker, wat de differentiële cel-celinteractievereisten voorstelt 9 . GJ, TJ en AJ zijn structureel en functioneel gekoppeld aan andere structurele of regulerende eiwitten aan de naburige plaatsen van aangrenzende cellen, waardoor een knooppunt 10 wordt gecreëerd. De samenstelling van de verbindingsneus kan invloed hebben op de overbruggen van het onderliggende cytoskelet, evenals de doorlaatbaarheid en de stabiliteit van de nexus, en kan derhalve de functie van de klier 8 , 9 , 10 , 11 beïnvloeden. De componenten van intercellulaire knooppunten die zich in knooppunten bevinden, of met elkaar in wisselwerking met elkaarGeurende ontwikkelingsfasen van de ontwikkeling van de borstklier werden onlangs geanalyseerd met behulp van co-immunofluorescentie (co-IF) en co-immunoprecipitatie (co-IP) 9 . Terwijl andere technieken de evaluatie van de functionele associatie tussen eiwitten mogelijk maken, worden deze methoden niet in dit manuscript gepresenteerd.
Aangezien eiwitten alleen maar alleen functioneren om te functioneren, is het belangrijk om veel onderzoekers te onderzoeken eiwit-eiwit interacties (PPI's), zoals signaaltransducties en biochemische cascades, en kunnen belangrijke informatie over de functie van eiwitten leveren. Co-IF en microscopische analyse helpen bij het evalueren van een paar eiwitten die dezelfde subcellulaire ruimte delen. Het aantal doelen is echter beperkt door de antilichamen die in verschillende dieren moeten worden opgewekt en door de toegang tot een confocale microscoop uitgerust met verschillende golflengtelaser en een spectrale detector voor multiplexing. Co-IP bevestigt of onthult fysische interacties met hoge affiniteit betwEen twee of meer eiwitten die binnen een eiwitcomplex verblijven. Ondanks de ontwikkeling van nieuwe technieken, zoals fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) 12 en proximity ligation assay (PLA) 13 , die gelijktijdig de lokalisatie en interacties van eiwitten kan detecteren, blijft co-IP een geschikte en betaalbare techniek om interacties tussen Endogene eiwitten.
De stap-voor-stap methode die in dit manuscript wordt beschreven, zal de studie van eiwitlokalisatie en PPI's vergemakkelijken en valkuilen verklaren om te vermijden bij het bestuderen van endogene PPI's in de borstklippen. De methodologie begint met de presentatie van de verschillende bewaringsprocedures voor de weefsels die nodig zijn voor elke techniek. In deel 1 wordt gepresenteerd hoe u co-lokalisatie van eiwitten in drie stappen kunt bestuderen: i) het segmenteren van mammekirtels, ii) de dubbele of drievoudige etikettering van verschillende eiwitten met behulp van de co-IF-techniek, en iii) het imago vanEiwit lokalisatie. Deel 2 laat zien hoe een endogeen eiwit neerslag wordt en zijn interactieproteïnen in drie stappen identificeren: i) lysatepreparatie, ii) indirecte eiwitimmunoprecipitatie, en iii) bindingspartneridentificatie door SDS-PAGE en Western blot. Elke stap van dit protocol is geoptimaliseerd voor knaagdierkankerweefsels en produceert hoogwaardige, specifieke en reproduceerbare resultaten. Dit protocol kan ook gebruikt worden als uitgangspunt voor PPI studies in andere weefsels of cellijnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell-cel interacties via kruispunten zijn nodig voor de juiste functie en ontwikkeling van veel organen, zoals de borstklier. Studies hebben aangetoond dat junctionele eiwitten de functie en stabiliteit van elkaar kunnen regelen en signaaltransductie activeren door elkaar te binden aan het celmembraan 10 . De protocollen die in het huidige manuscript zijn gepresenteerd, hebben interessante bevindingen geleverd over de interactie tussen de eiwitverschillen, lokalisatie en interactie tijdens de nor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IP wordt gefinancierd door een wetenschappelijke wetenschappelijke en technische onderzoeksraad van Canada (NSERC # 418233-2012); Een Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), een carriere-award voor Quebec Breast Cancer Foundation, en een Leader Founds-subsidie van de Canadian Foundation for Innovation grant. ED ontving een beurs van het Fondation universitaire Armand-Frappier.
Materials
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10X (stock) | 1) Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.4 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| TBS 10X (stock) | 1) Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.5 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1-Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Mentioned in Column D | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2-Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0 | 1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Mentioned in coulmn D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
- Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
- Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
- Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
- Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
- Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
- Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
- Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
- Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
- Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).
