Summary

Einfache Handhabung von Architekturen in Protein-basierte Hydrogele für Zelle Kultur Anwendungen

Published: August 04, 2017
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Summary

Verschiedene Methoden zu manipulieren, dreidimensionalen Architektur in Protein-basierte Hydrogele werden hier in Bezug auf die Materialeigenschaften ausgewertet. Die makroporöse Netze sind mit einer Zelle-Klebstoff-Peptid funktionalisiert und deren Umsetzbarkeit in der Zellkultur wird ausgewertet, mit zwei verschiedenen Modell-Zelllinien.

Abstract

Hydrogele sind anerkannte vielversprechende Materialien für Zelle Kultur Anwendungen aufgrund ihrer Fähigkeit, stark hydratisiert Zelle Umgebungen bereitzustellen. Bereich der 3D Vorlagen steigt wegen der möglichen Ähnlichkeit dieser Materialien, die natürliche extrazelluläre Matrix. Protein-basierte Hydrogele sind besonders Erfolg versprechend, weil sie leicht funktionalisiert können und definierte Strukturen mit einstellbaren physikalisch-chemischen Eigenschaften erreichen können. Allerdings ist die Produktion von makroporösen 3D Vorlagen für die Zelle Kultur Anwendungen mit natürlichen Materialien oft durch ihre schwächeren mechanische Eigenschaften im Vergleich zu synthetischen Materialien begrenzt. Hier wurden verschiedene Methoden ausgewertet, um makroporöse Rinderserumalbumin (BSA) produzieren-basierte Hydrogel-Systeme mit einstellbare Porengrößen im Bereich von 10 bis 70 µm im Umkreis. Darüber hinaus wurde eine Methode zur Erzeugung Kanäle in diesem Protein-basierten Material, das mehrere hundert Mikrometer lang sind. Die verschiedenen Methoden, Poren, sowie den Einfluss der Porengröße auf Materialeigenschaften wie Schwellungen, Verhältnis, pH-Wert, Temperaturstabilität und enzymatischen Abbau Verhalten, produzieren wurden analysiert. Porengrößen wurden im native, geschwollene Bundesstaat die Hydrogele mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie untersucht. Die Machbarkeit für Zelle Kultur Anwendungen wurde eine Zelle-Klebstoff RGD Peptid Modifikation des Systems der Protein und zwei Modell-Zelllinien bewertet: menschlichen Brustkrebszellen (A549) und adenocarcinomic menschlichen alveoläre basalen Epithelzellen (MCF7).

Introduction

Hydrogele sind Materialien, die bilden unlösliche 3D Netzwerke in der Lage, große Mengen an Wasser zu binden. Solche Materialien bieten hervorragende Bedingungen für lebende Zellen. Derzeit, steigt es Interesse bei der Erzeugung von dreidimensionalen Hydrogel Strukturen und der Entwicklung von Prozessen, deren chemischen und physikalischen Eigenschaften anzupassen. Sobald dies erreicht ist, kann eine Vorlage für das Wachstum von Zellen und die Manipulation von zellulären Verhalten generierte1,2,3,4. Diese 3D Strukturen schaffen nicht nur eine natürlichere und realistische Umgebung als herkömmlichen zweidimensionalen Ansätze, aber sie auch zeigen neue Möglichkeiten für das Wachstum von Stammzellen oder Tumor Modelle5. Unterschiedliche Materialien besitzen eine Reihe von Eigenschaften, die vor allem von der Porengröße des Gel6abhängen. Die Poren spielen eine entscheidende Rolle in Zelle Kultur Anwendungen, Gewebe-Engineering und das gerichtete Wachstum von Stammzellen. Beispielsweise mit Sauerstoff und Nährstoffen durch die Matrix diffundieren und ausreichende Mengen müssen möglicherweise die Zellen7zu erreichen. Auf der anderen Seite schädliche Stoffwechselprodukte müssen so schnell wie möglich entfernt werden, und ausreichend Platz für das Zellwachstum muss7verfügbar sein. Daher beeinflussen die Eigenschaften des Materials und somit die Porengröße stark nutzen und mögliche Einsatzmöglichkeiten der Matrix. Abhängig von den Eigenschaften des Materials, können verschiedene Zellwachstum Prozesse in 3D Zellkultur, einschließlich der Bildung von neuronalen Strukturen auftreten; das Wachstum und die Differenzierung von Zellen der Haut oder Knochen; und das gerichtete Wachstum der spezielle Zelllinien, wie Hepatozyten oder Fibroblasten2,3,8,9,10,11. Ein weiterer entscheidender Punkt Einfluss auf die mögliche Anwendung eines Materials ist seine Stabilität gegen äußere Reize12. Zum Beispiel muss das Hydrogel seine mechanische Integrität in Zellkulturmedien oder den menschlichen Körper pflegen.

In den letzten Jahren auf 3D Zelle Kultur Hydrogele intensiviert Forschung und zahlreiche Studien wurden durchgeführt, um die 3D Architekturen der Systeme13zu beheben. Hydrogele bestehend aus chemisch synthetisierten Komponenten sind am häufigsten untersucht, weil sie leicht synthetisiert und chemisch modifiziert werden können und sie hohen Stabilität weisen (siehe Zhu Et Al., 2011 eine Überprüfung)5. Proteine haben jedoch viele positive Eigenschaften: als so genannte “Präzision Polymere,” sie sind biokompatible; Sie haben eine definierte Länge; Sie sind relativ leicht zu ändern; und sie haben eine große Anzahl von Ziel-Websites14,15. In diesem Zusammenhang können hochspezifische, innovative Strukturen für den Einsatz in vielen Bereichen generiert werden. In dieser Studie wurde ein Protein-basierten Hydrogel-16 verwendet, zu zeigen, die Fähigkeit der etablierten Methoden 3D-Architektur des Materials zu beeinflussen. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit und die Anwendbarkeit zu Pore Generation auch untersucht.

Viele verschiedene Techniken stehen zur Verfügung, 3D Strukturen, einschließlich einfache Methoden und anspruchsvolle, hochspezialisierte Techniken aus verschiedenen Bereichen der materiellen Wissenschaft zu ändern. Eine weit verbreitete Technik ist die Verwendung von Elektrospinnen, klar definierte Strukturen17zu generieren. Geladene Fasern werden aus einer Lösung durch ein elektrisches Feld gezogen und dann nach Einwirkung von Sauerstoff zu festigen. Auf diese Weise können Fasern im Bereich von einigen Nanometern bis zu mehreren Mikrometern hergestellt werden. Zusätzliche Techniken, um die Größe, Struktur und Verteilung der Poren innerhalb der Matrix zu optimieren sind weiche Lithographie, Photolithographie, hydrodynamische Fokussierung, Elektro-Spritzen und Bio-Druck18,19,20. Ein erheblicher Nachteil dieser Techniken ist ihre Abhängigkeit von bestimmten, teure Ausrüstung und spezielle Chemikalien oder Materialien. Darüber hinaus Erfahrung mit diesen Techniken ist oft nicht direkt übertragbar auf Protein-basierten Materialien, und viele der Chemikalien und Methoden sind nicht kompatibel.

Auf der anderen Seite verlassen viele Techniken sich nicht auf spezielle Ausrüstung, so dass sie einfacher und billiger zu bewerben und zu reproduzieren. Eine weit verbreitete Methode zur Struktur Manipulation ist solvent Casting21,22,23. Partikel werden vor der Polymerisationsreaktion hinzugefügt und sind homogen verteilt, um die Lösung zu sättigen. Nach der Polymerisation führt eine Änderung der Bedingungen, wie eine Verdünnung oder eine pH-Wert-Änderung zu der Solvatation der Teilchen, während die Poren im Material bleiben. Die in diesen Techniken, wie Salz, Zucker, Paraffin, Gelatine und Kreide, verwendeten Chemikalien sind billig und überall verfügbar. Gefriertrocknung, sind geschwollene Hydrogele eingefroren. Die nachfolgenden Sublimierung der flüssigen Phasen unter Vakuum wird dann23,24,25durchgeführt. Wasser Sublimation aus dem Netzwerk ist sanft genug, um die spezifische 3D Strukturen des Materials beibehalten. Im Gas Schäumen ist eine Lösung mit einem Gas strömte, während die Polymerisation erfolgt, Poren im Gel21verlassen. Umfang und Verteilung der Poren können je nach dem Gasstrom eingestellt werden.

Um die Protein-Hydrogel zu bilden, wird BSA mit Tetrakis (Hydroxymethyl) Phosphonium-Chlorid (THPC) in einer Mannich-Typ-Reaktion ermöglicht die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen primären Aminen und die Hydroxygruppen der vierarmigen Linker Molekül26reagiert. Mögliche schädliche Zwischenprodukte werden durch übermäßiges Waschen des Materials entfernt, nachdem die Reaktion auftritt.

Diese Studie zeigt die Möglichkeit der Behandlung von einem BSA-basierte Material mit verschiedenen Techniken zu manipulieren und passen Sie die Größe der Poren. Jede der Techniken kann verwendet werden in jedem Labor weltweit, da keine besondere Ausrüstung notwendig ist. Darüber hinaus respektieren wie Schwellung Verhältnis, enzymatische Abbaubarkeit, pH-Stabilität und Temperaturempfindlichkeit, wurden untersucht und im Vergleich zu anderen, verschiedene Parameter, vor allem auf den Einfluss der verschiedenen Techniken auf die Erzeugung von 3D-Architekturen. Zu guter Letzt wurden die Materialien mit Zelle-Klebstoff Peptide zu untersuchen, die mögliche Anwendung der Materialien auf Zellkultur funktionalisiert. Zwei verschiedene Modell-Zell-Linien wurden verwendet: A549 und MCF7.

Protocol

(1) Hydrogel-Vorbereitung Mischen Sie 200 mg von BSA mit 1 mL entionisiertem H2O um 20 % (w/V) BSA Lager (Stammlösung) zu erstellen. Mix-165 µL THPC Lösung (134 mg/mL) mit 4,835 mL entionisiertem Wasser erstelle ich THPC Lösung (Stammlösung B) auf Lager. Wiegen Sie 1 mg KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/Mol) Peptid (oder eine gleichwertige Zelle-Klebstoff-Peptid) und verdünnen Sie es in 100 µL steriler H2O, 10 mg/mL Lösung (Stammlösung C) zu erhalten.Hinweis: Dieser…

Representative Results

Hydrogel development has become one of the most prominent fields in material research-related biological studies, with thousands of entries indexed in scientific research archives. Although the behavior of many systems is well studied, the manipulation of 3D networks, especially of sensitive protein-based materials, is often a major issue in material science. Another commonly underestimated challenge is the correct measurement of the native structure of a material using cryo electron micr…

Discussion

The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Baden-Württemberg Stiftung danken für ihre finanzielle Unterstützung im Rahmen “Muskelmodelle Material Synthese” (BioMatS-14).

Materials

Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) Life Technologies / Thermo Fisher  11140-050
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies / Thermo Fisher  10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies / Thermo Fisher  15140122
MEM Nonessential Amino Acid Solution Sigma Aldrich M7145-100ML
Trypsin EDTA 0.05 % Phenol Red Thermo Fisher Scientific 25300062
Ethanol 99.8 %, vergällt Ölfabrik Schmidt 2133
NaCl  Carl Roth  9265.1
Albumin Fraction V Carl Roth  3854.2
THPC Sigma Aldrich 404861-100ML Toxic
0.1 % Triton X 100 Sigma Aldrich X100-100ML Slightly toxic
Phalloidin-rhodamine  Life Technologies / Thermo Fisher  R415
3.7 % Formaldehyde  Life Technologies / Thermo Fisher  F8775-25ML Toxic
Rhodamine B Sigma Aldrich 81-88-9
Filtropur S 0.2,  Sarsted Ag und Co. 2 83.1826.001   
µ slide 8 well Ibidi GmbH 80826
KCSSGKSRGDS peptide UPEP Ulm Custom sysnthesis
Ethanol 99.8 %, vergällt Carl Roth  K928.5
Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 50 ml  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 1,5 ml   Sarsted Ag und Co. 72,690,001
Tubes 2 ml   Sarsted Ag und Co. 72,691
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM Greiner 655073
FreezeDryer Epsilon 1-6D,  Christ, Osterode am Harz, Germany
Confocal Laser Scanning Microscope  Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 GSA GmbH

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Cite This Article
Bodenberger, N., Kubiczek, D., Rosenau, F. Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (126), e55813, doi:10.3791/55813 (2017).

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