Summary

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

Published: August 04, 2017
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Summary

蛋白質ベースのヒドロゲルの三次元のアーキテクチャを操作するさまざまな方法は、材料特性に関してここで評価されます。マクロポーラス ネットワーク修飾が細胞接着ペプチドと細胞培養での実現性は、2 つの異なるモデルのセルラインを使用して評価されます。

Abstract

ヒドロゲルは能力高い水和セル環境を提供するため細胞培養用有望な材料として認識されます。3 D テンプレートのフィールドは自然の細胞外マトリックスにそれらの材料の潜在的な類似性のため上昇しています。蛋白質ベースのゲルは、彼らは簡単に機能集積化することができます、調整可能な物理化学的性質と定義済みの構造を達成することが特に有望です。ただし、天然素材を使用して細胞培養用マクロポーラス 3 D テンプレートの生産はしばしば合成材料のそれらと比較して自分より弱い機械的性質によって制限されます。ここで、マクロポーラス ウシ血清アルブミン (BSA) を生成するさまざまな方法を行った-半径 10 を 70 μ m の範囲で調整可能な細孔径を持つハイドロゲル システムします。さらに、数百ミクロンの長いこのタンパク質ベース素材のチャンネルを生成する法を確立しました。膨潤率、pH、温度安定性、酵素分解挙動などの材料特性に及ぼす細孔径と同様に、毛穴を生成するさまざまな方法が分析されました。共焦点レーザ走査型顕微鏡を使用してゲルのネイティブ、腫れた状態で細孔径を調べた。タンパク質系の 2 つのモデル細胞系細胞接着 RGD ペプチド修飾を使用して細胞培養用可能性を評価した: ひと乳癌細胞 (A549) と adenocarcinomic ひと歯槽基底上皮細胞 (MCF7)。

Introduction

ゲルは、大量の水をバインドできる不溶性の 3 D ネットワークを形成する材料です。そのような材料は、生きている細胞の優れた環境を提供できます。現在、三次元ハイドロゲル構造の生成とその化学的・物理的特性を調整するプロセスの開発、関心が、高まっています。これが達成されれば、細胞の増殖および細胞挙動の操作用のテンプレートは生成された1,2,3,4をすることができます。これらの 3 D 構造だけでなく環境を作成するより自然でリアルな二次元従来が、彼らよりも明らかに幹細胞の成長のための新たな可能性や腫瘍モデル5。異なる材料は、主に6ゲルの気孔のサイズに依存する特性の範囲を所有しています。毛穴は、電池文化、組織工学、幹細胞指向性の成長に重要な役割を再生します。たとえば、マトリックスを通して拡散酸素と栄養と十分な量は、セル7に到達できる必要があります。その一方で、有害な代謝産物は、できるだけ早く削除する必要がある、細胞の成長のための十分な領域が利用可能な7をする必要があります。その結果、材料、およびこうして細孔径のプロパティ深刻な行列の潜在的な利益と可能なアプリケーションに影響します。材料の特性に応じて、異なるセル成長過程は、神経構造の形成を含む、3 D の細胞の文化において発生することが成長と皮膚や骨の細胞の分化のような肝細胞や線維芽細胞2,3,8,9,10,11の特別な細胞ラインの監督の成長。物質の可能性のあるアプリケーションに影響を与えるもう一つの重要なポイントは、外部刺激12に向かってその安定性です。たとえば、ヒドロゲルへの細胞培養媒体または人間の体の機械的完全性を維持しなければなりません。

近年、激化、3 D 細胞培養ハイドロゲルに関する研究し、システム13の 3 D アーキテクチャを解決する多くの研究を行った。高い安定性を発揮し、簡単に合成および化学的に変更できるため化学的に合成された成分から成るハイドロゲルを調べた最も一般的5(朱2011 のレビューを参照してください)。しかし、タンパク質は多くの有益な特性をある: としていわゆる「精密高分子」彼らは生体適合性;ある定義された長さ;彼らも比較的容易に修正。ターゲット サイト14,15の大規模な数であります。この点では、特異性の高い、革新的な構造は、多くの分野でのアプリケーションの生成できます。本研究では蛋白質ベースのゲル16は、材料の 3 D アーキテクチャに影響を与える確立した方法の能力を発揮する使用されました。さらに、性と細孔生成への適用も検討しました。

簡単な方法と材料科学のさまざまな分野から、専門性の高い高度な技術の両方を含む、3 D 構造を変更するさまざまな方法があります。広範な技術は、明確に定義された構造17を生成するエレクトロスピニングの使用です。請求繊維電界印加によるソリューションから取得され、酸素への露出に固めます。このように、数ミクロンまで数ナノメートルの範囲の繊維を作り出すことができます。サイズ、構造、およびマトリックス内の気孔の分布を調整するための追加のテクニックは、ソフト ・ リソグラフィー、フォトリソグラフィ、流体を中心、エレクトロ スプレー、およびバイオ印刷18,19,20。これらの技術の重大な欠点は、特定の高価な装置や特別な化学薬品材料への依存関係です。さらに、これらの技術と経験が頻繁に蛋白質ベースの材料に直接譲渡と化学物質とメソッドの多くは、互換性のある細胞ではないです。

その一方で、多くの技術は特別な装置は、簡単かつ安価な適用し、再現するそれらを作るには頼らないでください。構造操作のため普及している方法は、溶液キャスト法21,22,23です。粒子は重合反応前に加えてゆくソリューションを飽和に配布されます。毛穴が材料内に残る、重合後、希釈や pH 変化などの条件の変化は粒子の溶媒和に します。塩、砂糖、パラフィン、ゼラチン、チョークなど、これらの技術で使用される化学物質は、安価で容易に入手できます。凍結、膨潤ゲルに固定されます。真空下で液相の後続の昇華は、23,24,25を実行します。ネットワークから水昇華は材料の特定の立体構造を維持するために十分な穏やかです。発泡ガス、重合が行われる、ゲル21孔を残している間に、ガスとソリューションはストリーミングされます。サイズと孔の分布は、ガスの流れによって調整できます。

タンパク質ゲルを形成、BSA はテトラキス (ヒドロキシメチル) ホスホニウム塩塩化 (THPC) 第一級アミンとリンカーの 4 武装分子26の水酸基との間に共有結合の形成を許可する Mannich 型反応と反応しました。可能な有害な中間体は、反応が発生した後、材料の余分な洗浄によって削除されます。

本研究では、BSA ベースの素材を操作し、細孔のサイズを調整するさまざまなテクニックを治療の可能性を紹介します。各技法使用できますあらゆる研究室で、世界中、特別な機器は必要ありません。さらに、パラメーターの異なるような膨潤率、酵素分解性、pH 安定性、温度感受性を検討され、それぞれに他と比較して特に尊重さまざまなテクニックの影響 3 D アーキテクチャの世代に。最後に、材料が修飾と細胞接着ペプチドの細胞培養の材料の適用の可能性を調査します。2 つの異なるモデル細胞ラインを使用した: A549 と MCF7。

Protocol

1. ゲルの調製 BSA の 200 mg をミックス 1 ml の脱イオン H2O 20% (w/v) BSA ストック (ストック溶液) を作成します。 ミックス 165 μ THPC ソリューション (134 mg/mL) 4.835 ml THPC を作成する純水の貯蔵液 (原液 B)。 KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) ペプチド (または同等の細胞接着ペプチド) の 1 mg の重量を量るし、滅菌 H2O 10 mg/mL 解 (原液 C) を得るための 100 μ L で希釈しています…

Representative Results

Hydrogel development has become one of the most prominent fields in material research-related biological studies, with thousands of entries indexed in scientific research archives. Although the behavior of many systems is well studied, the manipulation of 3D networks, especially of sensitive protein-based materials, is often a major issue in material science. Another commonly underestimated challenge is the correct measurement of the native structure of a material using cryo electron micr…

Discussion

The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、「バイオインスパイアード材料合成」フレームワーク (バイオマット-14) の金融支援財団はバーデン = ヴュルテンベルク州を感謝したいです。

Materials

Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) Life Technologies / Thermo Fisher  11140-050
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies / Thermo Fisher  10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies / Thermo Fisher  15140122
MEM Nonessential Amino Acid Solution Sigma Aldrich M7145-100ML
Trypsin EDTA 0.05 % Phenol Red Thermo Fisher Scientific 25300062
Ethanol 99.8 %, vergällt Ölfabrik Schmidt 2133
NaCl  Carl Roth  9265.1
Albumin Fraction V Carl Roth  3854.2
THPC Sigma Aldrich 404861-100ML Toxic
0.1 % Triton X 100 Sigma Aldrich X100-100ML Slightly toxic
Phalloidin-rhodamine  Life Technologies / Thermo Fisher  R415
3.7 % Formaldehyde  Life Technologies / Thermo Fisher  F8775-25ML Toxic
Rhodamine B Sigma Aldrich 81-88-9
Filtropur S 0.2,  Sarsted Ag und Co. 2 83.1826.001   
µ slide 8 well Ibidi GmbH 80826
KCSSGKSRGDS peptide UPEP Ulm Custom sysnthesis
Ethanol 99.8 %, vergällt Carl Roth  K928.5
Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 50 ml  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 1,5 ml   Sarsted Ag und Co. 72,690,001
Tubes 2 ml   Sarsted Ag und Co. 72,691
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM Greiner 655073
FreezeDryer Epsilon 1-6D,  Christ, Osterode am Harz, Germany
Confocal Laser Scanning Microscope  Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 GSA GmbH

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Cite This Article
Bodenberger, N., Kubiczek, D., Rosenau, F. Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (126), e55813, doi:10.3791/55813 (2017).

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