Простое управление архитектуры в гидрогели на основе белков для приложений культуры клеток
Summary
Различные методы обработки трехмерной архитектуры в гидрогели на основе белка здесь оцениваются в отношении свойств материала. Макропористые сетей функционализированных с пептидных клеток клей, и их возможности в клеточной культуре оценивается с помощью двух различных моделей клеточных линий.
Abstract
Гидрогели признаются в качестве перспективных материалов для приложений культуры клеток из-за их способности предоставлять сильно увлажненной клеток средах. Поле 3D шаблоны растет из-за потенциального сходство этих материалов естественной внеклеточного матрикса. Гидрогели на основе белка особенно перспективны, потому что они легко могут быть функционализированных и может достичь определенных структур с регулируемым физико-химических свойств. Однако производство Макропористые 3D шаблонов для приложений культуры клеток, с использованием натуральных материалов часто ограничивается их слабее механических свойств по сравнению с теми из синтетических материалов. Здесь различные методы были оценены производить Макропористые бычьим сывороточным альбумином (БСА)-на основе гидрогеля систем, с регулируемым порами размером в диапазоне от 10 до 70 мкм в радиусе. Кроме того был создан метод для создания каналов в этот материал на основе белков, которые являются несколько сотен микрон длиной. Были проанализированы различные методы для производства поры, а также влияние размера пор на материальных свойств, таких как отеки соотношение, рН, стабильность температуры и поведение энзимной деградации. Размеры пор были исследованы в родной, раздутый штат гидрогели, используя Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Возможности для приложений культуры клеток оценивалась с использованием клеток клей РСЗ пептид модификация белков системы и две модели клеточных линий: рак молочной железы человека клетки (A549) и adenocarcinomic альвеолярного базальной эпителиальных клеток человека (MCF7).
Introduction
Гидрогели являются материалы, которые образуют нерастворимые 3D сетей, способных привязки больших количеств воды. Такие материалы могут обеспечить отличные экологические условия для живых клеток. В настоящее время растет интерес в поколении трехмерной гидрогеля структур и в разработке процессов, адаптировать их химические и физические свойства. Как только это будет достигнуто, шаблон для роста клеток и манипуляции клеточного поведения может быть созданный1,2,3,4. Эти 3D структуры не только создать более естественный и реалистичный окружающей среды, чем обычные двухмерные подходы, но они также выявить новые возможности для роста стволовых клеток или опухоль модели5. Различные материалы имеют ряд характеристик, которые главным образом зависят от размера поры геля6. Поры играют решающую роль в клетки культуры приложениями, тканевой инженерии и режиссер роста стволовых клеток. Например кислород и питательные вещества диффузного через матрицу, и надлежащей суммы должны быть в состоянии достичь клетки7. С другой стороны вредные метаболиты необходимо удалить как можно быстрее, и достаточно места для роста клеток должны быть доступны7. Следовательно свойства материала и таким образом размер пор, серьезно влиять на потенциальные выгоды и возможности применения матрицы. В зависимости от свойств материала, различные роста клеток процессов может произойти в 3D клеточной культуры, включая формирование нейрональных структур; роста и дифференцировки клеток кожи или кости; и режиссер рост линий специальных стволовых клеток, как гепатоцитов или фибробластов2,3,8,9,10,11. Другой важный момент, влияющих на возможность применения материала является его стабильность на внешние раздражители12. К примеру гидрогеля должны поддерживать свою механическую целостность в СМИ культуры клеток или человеческого тела.
В последние годы, исследования по 3D клетки культуры гидрогели активизировались, и многие исследования были проведены для разрешения 3D архитектуры систем13. Гидрогели, состоящий из химически синтезированных компонентов исследованы наиболее часто потому, что они могут быть легко синтезируется и химически изменены, и они обладают высокой стабильностью (см. Чжу et al., 2011 для обзора)5. Однако белки имеют много полезных свойств: как так называемые «точность полимеров,» они биосовместимых; они имеют определенной длины; они являются относительно легко изменить; и они имеют большое количество целевых сайтов14,15. В этой связи весьма специфические, инновационные структуры могут быть созданы для применения во многих областях. В этом исследовании гидрогеля на основе белков16 был использован для демонстрации устоявшихся методов способность влиять на 3D архитектура материала. Кроме того возможность и применимости в поры поколения также было расследовано.
Многие различные методы доступны для изменения трехмерных структур, включая как простые методы, так и сложные, высоко специализированные методы из разных областей науки материала. Метод широко используется electrospinning для создания четко определенных структур17. Заряженные белки берутся из раствора путем электрического поля и затем затвердевают при воздействии кислорода. Таким образом могут быть изготовлены волокна в диапазоне нескольких нанометров до нескольких микрон. Дополнительные методы, чтобы настроить размер, структура и распределение поры в пределах матрицы являются мягкие литографии, фотолитографии, гидродинамические упором, электро напыления и био печать в18,19,20. Существенный недостаток этих методов является их зависимость от конкретных, дорого оборудования и специальных химических веществ или материалов. Кроме того опыт работы с этими методами часто не непосредственно передавать материалы на основе белков, и многие из химических веществ и методов не являются клетки совместимы.
С другой стороны многие методы не полагаться на специальное оборудование, что делает их легче и дешевле, чтобы применить и воспроизвести. Распространенным методом манипуляции структуры является растворителем литья21,,2223. Частицы добавляются до реакции полимеризации и содержанием однородно распределяются насытить решения. После полимеризации изменение условий, таких как ослабление или изменение рН, приводит к сольватации частиц, в то время как поры остаются в пределах материала. Химические вещества, используемые в этих методов, таких как соль, сахар, парафин, желатин и мела, дешевые и легко доступны. В для, опухшие гидрогели замораживаются. Последующее сублимации жидких фаз под вакуумом, затем выполняется23,24,25. Сублимация воды из сети достаточно мягкий, чтобы поддерживать конкретные 3D структуры материала. В Газе пенообразование решение передается с газом при полимеризации происходит, оставляя поры внутри гель21. Размер и распределение пор может корректироваться в зависимости от потока газа.
Для формирования белков гидрогеля, BSA реагирует с тетракис (гидроксиметил) фосфониевую хлорид (THPC) в реакция Манниха типа для формирования ковалентных связей между первичных аминов и гидрокси группы Четырёхрукий компоновщика молекулы26. Возможные вредные интермедиатов удаляются промывкой чрезмерным материала после того, как происходит реакция.
Это исследование демонстрирует возможность лечения с различные методы, чтобы управлять и настраивать размер поры материала, на основе BSA. Каждый из методов может использоваться в любой лаборатории во всем мире, как никакого специального оборудования является необходимым. Кроме того различные параметры, такие как отек соотношение, ферментативные разлагаемость, рН стабильность и чувствительность температуры, были рассмотрены и по сравнению друг с другом, особенно применительно к влияние различных методов на поколение 3D архитектуры. Наконец материалы были функционализированных с пептидами клеток клей для расследования возможного применения материалов для клеточной культуры. Были использованы две различных модели клеточные линии: A549 и MCF7.
Protocol
Representative Results
Discussion
The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Баден-Вюртемберг Stiftung за их финансовую поддержку в рамках «Bioinspired материал синтез» (биотекстили-14).
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) | Life Technologies / Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies / Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies / Thermo Fisher | 15140122 | |
| MEM Nonessential Amino Acid Solution | Sigma Aldrich | M7145-100ML | |
| Trypsin EDTA 0.05 % Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Ölfabrik Schmidt | 2133 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| Albumin Fraction V | Carl Roth | 3854.2 | |
| THPC | Sigma Aldrich | 404861-100ML | Toxic |
| 0.1 % Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Slightly toxic |
| Phalloidin-rhodamine | Life Technologies / Thermo Fisher | R415 | |
| 3.7 % Formaldehyde | Life Technologies / Thermo Fisher | F8775-25ML | Toxic |
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | 81-88-9 | |
| Filtropur S 0.2, | Sarsted Ag und Co. | 2 83.1826.001 | |
| µ slide 8 well | Ibidi GmbH | 80826 | |
| KCSSGKSRGDS peptide | UPEP Ulm | Custom sysnthesis | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Carl Roth | K928.5 | |
| Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 50 ml | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 1,5 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,690,001 | |
| Tubes 2 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,691 | |
| CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM | Greiner | 655073 | |
| FreezeDryer Epsilon 1-6D, | Christ, Osterode am Harz, Germany | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 | GSA GmbH |
References
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
- Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
- Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
- Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
- Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
- Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
- Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
- Chiu, Y. -. C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
- Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
- Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker’s yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
- Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
- Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
- Selimović, &. #. 3. 5. 2. ;., Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
- Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
- Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
- Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
- Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
- Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
- Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
- Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
- Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
- Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices–Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
- Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
- Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).
