Fácil manipulação das arquiteturas em hidrogel à base de proteínas para aplicações de cultura de células
Summary
Diferentes métodos para manipular a arquitetura tridimensional em hidrogel à base de proteínas são avaliados aqui com respeito a propriedades do material. As redes se são acrescidas com um peptídeo de célula-adesivo, e sua viabilidade na cultura de pilha é avaliada usando duas linhas de células de modelo diferente.
Abstract
Hidrogel é reconhecidos como materiais promissores para aplicações de cultura de células devido à sua capacidade para fornecer ambientes de célula altamente hidratado. O campo de modelos 3D está a aumentar devido à semelhança potencial desses materiais para a matriz extracelular natural. Hidrogel à base de proteínas é particularmente promissor, porque pode facilmente ser acrescidas e pode atingir estruturas definidas com propriedades físico-químicas ajustáveis. No entanto, a produção de modelos 3D de se para aplicações de cultura de células utilizando materiais naturais é muitas vezes limitada pela suas propriedades mecânicas mais fracas em comparação com as de materiais sintéticos. Aqui, diferentes métodos foram avaliados para produzir se albumina de soro bovino (BSA)-com base em sistemas de hidrogel, com tamanhos de poros ajustável na faixa de 10 a 70 µm no raio. Além disso, estabeleceu-se um método para gerar canais neste material à base de proteínas que são vários cem mícrons longos. Os diferentes métodos para produzir os poros, bem como a influência do tamanho dos poros em propriedades materiais, tais como inchaço ratio, pH, estabilidade de temperatura e comportamento de degradação enzimática, foram analisados. Tamanho dos poros foram investigado no estado nativo, inchado do hidrogel usando laser confocal, microscopia eletrônica de varredura. A viabilidade para aplicações de cultura de células foi avaliada com célula-adesivo RGD peptídeo modificação do sistema de proteína e duas linhas de célula modelo: células de câncer de mama humano (A549) e adenocarcinomic alveolares basais epiteliais células humanas (MCF7).
Introduction
Hidrogel é materiais que formam redes 3D insolúveis capaz de ligação a grandes quantidades de água. Tais materiais podem fornecer excelentes condições ambientais para as células vivas. Atualmente, existe uma crescente interesse na geração de estruturas tridimensionais de hidrogel e no desenvolvimento de processos para adequar suas propriedades químicas e físicas. Uma vez que este é alcançado, um modelo para o crescimento das células e a manipulação do comportamento celular pode ser gerado1,2,3,4. Estas estruturas 3D não só criam um ambiente mais natural e realista do que abordagens convencionais bidimensionais, mas eles também revelar novas possibilidades para o crescimento de células-tronco ou tumor modelos5. Diferentes materiais possuem uma gama de características que principalmente depende do tamanho dos poros do gel de6. Os poros desempenham um papel crucial em aplicações de cultura de células, a engenharia de tecidos e o crescimento direcionado de células-tronco. Por exemplo, oxigênio e nutrientes difundem pela matrix, e quantidades adequadas devem ser capazes de atingir as células7. Por outro lado, metabólitos prejudiciais devem ser removidos logo que possível, e espaço suficiente para o crescimento da célula deve ser disponível7. Consequentemente, as propriedades do material e, portanto, o tamanho dos poros, influenciam severamente os potencial benefício e possível aplicações da matriz. Dependendo as propriedades do material, processos de crescimento de células diferentes podem ocorrer em cultura de células 3D, incluindo a formação de estruturas neuronais; o crescimento e diferenciação das células da pele ou osso; e o crescimento direcionado de linhas de células-tronco especiais, como hepatócitos ou fibroblastos2,3,8,9,10,11. Outro ponto crucial, influenciando a possível aplicação de um material é a sua estabilidade no sentido de estímulos externos12. Por exemplo, o hidrogel deve manter sua integridade mecânica em meios de cultura celular ou o corpo humano.
Nos últimos anos, pesquisas sobre cultura de células 3D hidrogel intensificou-se, e muitos estudos foram realizados para resolver as arquiteturas 3D dos sistemas13. Hidrogel composto por componentes quimicamente sintetizados mais comumente é investigados, porque podem ser facilmente sintetizados e quimicamente modificados e eles apresentam alta estabilidade (veja Zhu et al, 2011 para uma revisão)5. No entanto, as proteínas têm muitas propriedades benéficas: tão chamados “polímeros de precisão”, eles são biocompatíveis; Eles têm um comprimento definido; Eles são relativamente fáceis de modificar; e eles têm um grande número de sites de destino14,15. A este respeito, estruturas inovadoras, altamente específicas podem ser geradas para aplicação em muitos campos. Neste estudo, um hidrogel à base de proteína de16 foi usado para demonstrar a capacidade de bem estabelecidos métodos para influenciar a arquitetura 3D do material. Além disso, a capacidade de e aplicabilidade para geração de poros também foi investigada.
Muitas técnicas diferentes estão disponíveis para modificar estruturas 3D, incluindo ambos os métodos simples e técnicas sofisticadas, altamente especializadas de diferentes áreas da ciência de materiais. Uma técnica comum é o uso de eletrofiação para gerar estruturas bem definidas17. Carregada de fibras são puxadas a partir de uma solução por um campo elétrico e em seguida solidificam após a exposição ao oxigênio. Desta forma, podem ser produzidas fibras no intervalo de vários nanômetros até alguns mícrons. Técnicas adicionais para ajustar o tamanho, estrutura e distribuição dos poros dentro da matriz são macia litografia, fotolitografia, focalização hidrodinâmica, electro-pulverização e bio-imprimir18,19,20. Uma desvantagem significativa dessas técnicas é sua dependência específico, caros equipamentos e produtos químicos especiais ou materiais. Além disso, a experiência com estas técnicas, muitas vezes não é diretamente transferível para materiais à base de proteínas, e muitos dos produtos químicos e métodos não são celulares compatíveis.
Por outro lado, muitas técnicas não se baseará equipamento especial, tornando-os mais fácil e mais barato para aplicar e reproduzir. Um método generalizado para manipulação de estrutura é solvente fundição21,22,23. As partículas são adicionadas antes da reação de polimerização e são distribuídas homogênea até para saturar a solução. Após a polimerização, uma mudança de condições, tais como uma diluição ou uma alteração de pH, leva para a solvatação das partículas, enquanto os poros permanecem dentro do material. Os produtos químicos utilizados nestas técnicas, tais como sal, açúcar, parafina, gelatina e giz, são baratas e prontamente disponíveis. Na liofilização, hidrogel inchadas está congelados. A sublimação subsequente das fases líquidas sob um vácuo é então realizada23,24,25. Sublimação da água da rede é suficientemente suave para manter as estruturas 3D específicas do material. Em gás de espuma, uma solução é transmitida com um gás durante a polimerização ocorre, deixando os poros dentro do gel de21. O tamanho e a distribuição dos poros podem ser ajustadas dependendo do fluxo de gás.
Para formar a proteína hidrogel, BSA é reagido com cloreto de tetrakis (hidroximetil) do phosphonium (THPC) em uma reação de Mannich-tipo para permitir a formação de ligações covalentes entre aminas primárias e os grupos hidroxi de 4 braços vinculador molécula26. Possíveis intermediários prejudiciais são removidos por lavagem excessiva do material, depois que a reação ocorre.
Este estudo demonstra a possibilidade de tratar de um material à base de BSA com diferentes técnicas para manipular e ajustar o tamanho dos poros. Cada uma das técnicas pode ser usada em qualquer laboratório em todo o mundo, como nenhum equipamento especial é necessário. Além disso, diferentes parâmetros, tais como inchaço ratio, degradabilidade enzimática, estabilidade do pH e sensibilidade à temperatura, foram examinados e comparados uns aos outros, especialmente respeitam à influência das diferentes técnicas na geração de arquiteturas 3D. Finalmente, os materiais foram acrescidos com peptídeos de célula-adesivo para investigar a possível aplicação dos materiais para cultura de células. Utilizaram-se duas linhas de célula diferente modelo: A549 e MCF7.
Protocol
Representative Results
Discussion
The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer seu apoio financeiro no quadro “Síntese de Material Bioinspirada” (BioMatS-14) Stiftung Baden-Württemberg.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) | Life Technologies / Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies / Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies / Thermo Fisher | 15140122 | |
| MEM Nonessential Amino Acid Solution | Sigma Aldrich | M7145-100ML | |
| Trypsin EDTA 0.05 % Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Ölfabrik Schmidt | 2133 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| Albumin Fraction V | Carl Roth | 3854.2 | |
| THPC | Sigma Aldrich | 404861-100ML | Toxic |
| 0.1 % Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Slightly toxic |
| Phalloidin-rhodamine | Life Technologies / Thermo Fisher | R415 | |
| 3.7 % Formaldehyde | Life Technologies / Thermo Fisher | F8775-25ML | Toxic |
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | 81-88-9 | |
| Filtropur S 0.2, | Sarsted Ag und Co. | 2 83.1826.001 | |
| µ slide 8 well | Ibidi GmbH | 80826 | |
| KCSSGKSRGDS peptide | UPEP Ulm | Custom sysnthesis | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Carl Roth | K928.5 | |
| Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 50 ml | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 1,5 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,690,001 | |
| Tubes 2 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,691 | |
| CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM | Greiner | 655073 | |
| FreezeDryer Epsilon 1-6D, | Christ, Osterode am Harz, Germany | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 | GSA GmbH |
References
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
- Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
- Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
- Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
- Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
- Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
- Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
- Chiu, Y. -. C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
- Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
- Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker’s yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
- Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
- Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
- Selimović, &. #. 3. 5. 2. ;., Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
- Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
- Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
- Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
- Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
- Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
- Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
- Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
- Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
- Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices–Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
- Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
- Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).
