Summary
Che caratterizzano la funzione dei recettori odorant serve una parte indispensabile nel processo di deorphanization. Descriviamo un metodo per misurare l'attivazione di recettori di odorizzante in tempo reale usando un'analisi di campo.
Abstract
Le enormi dimensioni delle famiglie dei mammiferi odorant receptor (OR) presentano difficoltà per trovare loro ligandi affine fra numerosi prodotti chimici volatili. Per efficientemente ed esattamente deorphanize ORs, uniamo l'uso di una linea cellulare eterologo di esprimere dei mammiferi ORs e un plasmide biosensore geneticamente per misurare la produzione di cAMP a valle dell'attivazione di OR in tempo reale. Questa analisi può essere usata per schermo odoranti contro ORs e viceversa. Interazioni positive odorant-recettore degli schermi possono essere successivamente confermate dalla prova contro varie concentrazioni di odore, generando curve concentrazione-risposta. Qui abbiamo usato questo metodo per eseguire uno screening di alto-rendimento di un composto odoroso contro una libreria OR umana espressa in cellule Hana3A e confermato che il recettore risponde positivamente il recettore affine per il composto di interesse. Abbiamo trovato questo metodo di rilevamento ad alta velocità per essere efficiente e affidabile nel valutare l'attivazione OR e i nostri dati forniscono un esempio del suo uso potenziale negli studi funzionali OR.
Introduction
L'odorato svolge un ruolo importante nella sopravvivenza degli animali come si basano sulla loro capacità olfattive per procurarsi il cibo, evitare i predatori e pericolo, distinguere specie e selezionare mate1,2. La realizzazione di queste funzioni dipende i recettori odorant (ORs), che individualmente sono espressi sulla superficie ciliare dei neuroni sensoriali olfattivi (OSNs) situato nell'epitelio olfattivo (OE). RUP costituiscono la più grande famiglia della superfamiglia del recettore (GPCR) accoppiati a proteine G con circa 400 e 1200 diversi OR geni nell'uomo e topo, rispettivamente3,4,5. ORs attivato da odoranti condurre ai livelli aumentati di cAMP intracellulari attraverso l'attivazione sequenza di olfattiva G-proteina (Golf) e digitare adenilil ciclasi III (AC3). Il risultante aumento del livello di cAMP intracellulare potrebbe funzionare come un secondo messaggero, che apre il canale del nucleotide-gated sulla superficie delle cellule, innescando l'afflusso dei cationi inclusi Ca2 + e potenziali d'azione e in ultima analisi, avviare neuro-potenziale trasmissione e percezione olfattiva. Il processo di rilevamento e discriminare un gran numero di odorizzazione da ORs è considerato come il primo passo di percezione olfattiva6,7.
Poiché Buck e Axel8 prima con successo odorant recettori clonati e chiarito il meccanismo di percezione olfattiva iniziata da ORs, deorphanization della famiglia OR è diventato uno dei punti caldi in questo campo. Vari metodi in vivo, ex vivo ed in vitro per misurare l'attivazione OR sono stati segnalati9,10,11,12. Un metodo tradizionale che utilizzato Ca2 + imaging seguita da unicellulare RT-PCR su OSNs permesso l'identificazione di differenti ORs a alifatici odoranti13,14,15. Più recentemente, l'avvento delle analisi su larga scala del trascrittoma promosso lo sviluppo di metodi di più alto-rendimento in vivo . Il dosaggio di Kentucky identificato ORs eugenolo e muscone-reattivo del mouse con l'uso di S100a5-tauGFP reporter del mouse ceppo e microarray analisi9. Basato sulla diminuzione nei livelli di mRNA di OR dopo l'esposizione odorant, la tecnologia di sogno impiegato un approccio di trascrittomica per determinare i profili di attivazione OR in due specie di vertebrati e non-vertebrato16. Allo stesso modo, data la fosforilazione di S6 in attivazioni neuronali, il Matsunami gruppo sequenziata mRNA dal ribosoma fosforilato immunoprecipitati per identificare reattivo ORs12. Infine, il gruppo di Feinstein segnalato topi super sniffer che potrebbero fungere da piattaforma per lo studio di odore di codifica in vivo, conosciuto come il MouSensor tecnologia17.
Nel Regno in vitro , la sfida di coltura OSNs rende un sistema di espressione eterologa che imita OR espressione funzionale in vivo una soluzione ideale per condurre lo screening su larga scala di prodotti chimici odorosi per ORs. Tuttavia, dal momento che diverse linee cellulari coltivate di origine non-olfattiva OSNs nativo, o proteine vengono mantenute nel reticolo endoplasmatico e incapace di traffico alla membrana plasmatica, con conseguente OR degrado e la perdita di funzione del ricevitore18 , 19. per risolvere questo problema, vasti impianti sono stati fatti per replicare o funzionale espressione sulla membrana cellulare nelle linee cellulari eterologhi. Krautwurst et al collegato in primo luogo i primi 20 amminoacidi di rodopsina (Rho-tag) al N-terminale della proteina OR e questo ha promosso l'espressione di superficie delle cellule di alcuni ORs di cellule embrionali umane del rene (HEK)20. Effettuando un'analisi di serie di analisi del gene expression (SAGE) libreria dal singolo OSNs, Saito et al. in primo luogo clonato i membri della famiglia della proteina (RTP) del ricevitore-trasporto, RTP1 e RTP2 e la proteina di enhancer di espressione di recettore 1 (REEP1) che ha facilitato OR traffico alla membrana cellulare e migliorato risposte odorant-mediata di ORs in HEK293T cellule 21. basato su questi risultati, il gruppo Matsunami stabilito con successo la linea cellulare Hana3A, trasfettata stabilmente con RTP1, RTP2, REEP1 e Gαolf in HEK293T e transfected transitoriamente con ORs Rho-etichetta, per efficiente o funzionale espressione. Successivi studi hanno rivelato 1) una forma più breve di RTP1, RTP1S, che potrebbe più robustamente promuovono o funzione che la proteina RTP1 originale e 2) il recettore muscarinico tipo 3 (M3R) poteva migliorare attività OR via inibizione di β-arrestina-2 reclutamento, entrambi i quali sono state introdotte per il sistema di espressione eterologa per ottimizzare sperimentale uscita22,23.
Diversi metodi di rilevamento sono stati utilizzati per quantificare l'attivazione del recettore in sistemi eterologhi. Il dosaggio di fosfatasi alcalina placentare secrete (SEAP) funziona con un enzima di reporter trascrizionalmente regolato da elementi di risposta del campo (CREs), che lo rende un'opzione attraente per valutare l'attivazione OR. La fluorescenza è facilmente rilevata in un campione di terreno di coltura dopo incubazione con SEAP rilevamento reagente24. Utilizzando questo metodo, le funzioni di RUP, nonché una classe secondaria di chemosensory recettori espressi nella traccia di OE-i recettori ammina-associati (TAARs) sono stati caratterizzati25,26,27. Un altro metodo comune, l'analisi di luciferase, utilizza un gene reporter luciferasi di lucciola sotto il controllo dell'elemento di risposta del campo (CRE). Luminescenza generato dalla produzione di luciferasi di misurazione fornisce un mezzo efficiente e robusto di quantificare OR attivazione10,11,28.
Analisi di campo in tempo reale anche sono stati ampiamente usate nel monitoraggio in modo dinamico la funzione dei GPCR eterologo o endogena. Un esempio di tali dosaggi avanzate si avvale di una variante di biosensore codificato geneticamente, che possiede un dominio di legame al cAMP fuso ad una forma mutante della luciferasi. Quando si lega l'accampamento, il cambiamento conformazionale conduce all'attivazione della luciferasi, luminescenza da cui poi può essere misurata con un lettore di chemiluminescenza29,30. La tecnologia di campo in tempo reale è stata segnalata per la de-orfano di umano odorant recettori nelle cellule 108CC15 HEK293 e NxGculo = "xrif" > 31,32,33, come pure il Hana3A derivato di HEK293T cellule34,35. Il gruppo Krautwurst anche descritto in dettaglio la tecnologia di campo in tempo reale per essere adatti alla bi-direzionale su larga scala o screening approcci32,33.
Qui descriviamo un protocollo per la misurazione di attivazione OR usando un'analisi in tempo reale di cAMP nelle cellule Hana3A. In questo protocollo, la luminescenza di pre-equilibrato di cellule vive è cineticamente misurata per 30 min dopo il trattamento con specifici composti volatili, che rappresentano un'analisi più efficiente e accurata di attivazione OR che sono meno suscettibili artefatti che si verificano nell'ambiente cellulare con tempo prolungato e le tossicità indotta da odore delle cellule. Questa misura in tempo reale consente uno screening su larga scala di ORs e di ligandi, come pure la caratterizzazione di coppie di OR-ligando specifiche di interesse. Usando questo metodo, correttamente identificato OR5AN1 come il recettore per il muschio composto muscone eseguendo uno screening contro 379 ORs umano e successivamente conferma il risultato di screening positivo.
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Protocol
1. Culturing e manutenzione di celle Hana3A
- mantenere le cellule in 10 mL di medium essenziale minimo (MEM) con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 µ g/mL di penicillina-streptomicina e 1.25 µ g/mL amfotericina B in un 100-mm piastra di coltura di cellule in un'incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C con 5% CO 2. Con ogni altro passaggio, aggiungere 1 con puromicina µ g/mL per mantenere la trasfezione stabile di plasmidi (Vedi Introduzione).
Nota: Eseguire tutti i passaggi che coinvolgono la coltura delle cellule in una cappa di sicurezza biologica di II classe per garantire ambiente sterile. - Sottocultura ad un rapporto di 10-20% in 100 mm piatti ogni 2-3 giorni.
2. Placcatura di cellule per la transfezione
- osservare le cellule di Hana3A sotto un microscopio a contrasto di fase per garantire la vitalità cellulare e stimare confluenza.
- Aspirare tutte le medie da piastra di coltura cellulare.
- Lavare le cellule aggiungendo 10 mL di tampone fosfato salino (PBS) sul piatto, il piatto di turbine, e aspirando il PBS.
- Aggiungere 3 mL di 0.05% tripsina-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) sulla piastra. Mix per 1 min o fino a quando tutte le celle vengono a galla.
Nota: Osservare il progresso delle cellule lo scollegamento dalla parte inferiore della piastra sotto il microscopio come necessario. - Inactivate tripsina aggiungendo 5 mL di MEM con 10% FBS e pipetta su e giù per rompere blocchi di cell mass.
Nota: Per la placcatura prima della trasfezione, il mezzo utilizzato non deve contenere antibiotici. Aggiunta di antibiotici può ridurre l'efficienza di trasfezione. - Trasferire una quantità appropriata di cellule in una provetta 15-mLl a seconda del numero di piastre per essere transfected. Per ogni piastra a 96 pozzetti, piastra 2 x 10 6 celle o circa 1/5 di un piatto di confluenti 100 mm 100%, dando un conteggio delle cellule di 2 x 10 4 cellule per pozzetto o di una densità di circa 15-30% di confluenza per pozzetto. Centrifugare le provette a 200 x g per 5 min e aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
Nota: Calcolare la corretta quantità di cellule per essere piastrate su piastre a 96 pozzetti per evitare surclassando o undergrowing cellule prima stimolazione. - Aggiungere una quantità appropriata di MEM con 10% FBS nel 15 mL tubo e pipettare su e giù per rompere blocchi della cella di massa. Per ogni piastra a 96 pozzetti, risospendere le cellule con 6 mL di MEM con 10% FBS.
Nota: Fare attenzione a non generare bolle d'aria nel tubo. - Aggiungere le cellule sospese in un serbatoio. Usando una pipetta multicanale, pipettare 50 µ l di cellule su ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Incubare per una notte a 37 ° C con 5% CO 2.
3. Transfezione di plasmidi
- prima della trasfezione, osservare le cellule placcate per garantire una corretta confluenza di circa 30-50% per pozzetto sotto un microscopio a contrasto di fase e tornare nell'incubatore.
- Preparare in anticipo il Rho-etichetta OR costrutto 11 , 21 , 22 , 28, il fattore accessorio costruisce (RTP1S 22 , 36 e M3R 23), e la variante di biosensore costruire 29 , 30 di miniprep. Quantificare la concentrazione di DNA da uno spettrofotometro e regolare le concentrazioni di DNA del plasmide (ad es., a 100 ng / µ l) con acqua distillata come necessario.
- Preparazione delle miscele di transfezione
- preparare una miscela di transfezione del plasmide in 500 µ l di MEM per ogni piastra a 96 pozzetti secondo la tabella 1.
Nota: Quando diversi ORs vengono testati sulla stessa piastra 96 pozzetti, il volume della miscela di transfezione e la quantità di plasmide DNA aggiunto deve essere adattato in funzione del numero di pozzi trasfettate con un determinato OR. - Preparare una miscela di transfezione in un tubo con 18 µ l di reagente di transfezione mediata del lipido in 500 µ l di MEM.
- preparare una miscela di transfezione del plasmide in 500 µ l di MEM per ogni piastra a 96 pozzetti secondo la tabella 1.
- Mescolare la miscela di plasmide con la miscela di transfezione pipettando su e giù. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Fermare la reazione aggiungendo 5 mL di MEM con 10% FBS.
- Stendere uno strato spesso di asciugamani di carta sterile nella cappa di cultura cellulare. Prendere una piastra a 96 pozzetti con cellule dall'incubatrice. Delicatamente e ripetutamente toccare la piastra capovolta sulla pila di carta assorbente in modo che il mezzo è completamente assorbito dal tovagliolo di carta.
Nota: Non con la forza o bruscamente toccare la piastra come uno potrebbe perdere cellule. - Trasferire 50 µ l della miscela combinata transfezione in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti e incubare per una notte per 18-24 h a 37 ° C con 5% CO 2.
Nota: Una pianificazione di transfezione e stimolazione tempo gestito deve precedere la misurazione quando più di una piastra a 96 pozzetti vengono testati in un esperimento al fine di avere tutte le piastre misurate dopo la transfezione contemporaneamente e il tempo di esposizione di stimolo.
4. Stimolazione e misurazione o attività usando l'analisi di Campo Real-Time
- osservare le cellule trasfettate con un microscopio a contrasto di fase per garantire una corretta confluenza di 50-80% per pozzetto e tornare nell'incubatore.
- Preparare il supporto di stimolazione aggiungendo 10mm idrossietil piperazineethanesulfonic acido (HEPES) e 5 mM glucosio a Hank ' s soluzione salina bilanciata (HBSS).
- Scongelare le aliquote di reagente substrato in tempo reale analisi accampamento sul ghiaccio. Conservare substrato reattivo a-80 ° C a 55 µ l per provetta in provette per PCR. Utilizzare 1 tubo per piastra.
- Preparare 2% soluzione di equilibrazione con 55 µ l del reagente substrato e soluzione di HBSS/HEPES/glucosio 2750 µ l.
- Stendere uno strato spesso di asciugamani di carta in panchina. Delicatamente e ripetutamente toccare la piastra capovolta su carta assorbente in modo che il mezzo di transfezione è completamente assorbito dal tovagliolo di carta.
- Lavare le cellule di pipettaggio 50 µ l di soluzione di HBSS/HEPES/glucosio in ciascun pozzetto.
- Delicatamente e ripetutamente toccare la soluzione di HBSS/HEPES/glucosio dalla piastra a 96 pozzetti.
- Pipetta 25 µ l della soluzione di equilibrazione 2% ad ogni pozzetto ed incubare a temperatura ambiente al buio per 2 h.
- Preparare in anticipo 1m odorant soluzioni di riserva in DMSO e conservare a-20 ° C fino a quando non usato.
- Prima della fine del tempo di incubazione, diluire le soluzioni stock odorant a concentrazioni di lavoro nel mezzo di stimolazione glucosio/HBSS/HEPES.
Nota: Le concentrazioni delle diluizioni odorant preparate in questo passaggio devono essere raddoppiate per ottenere le concentrazioni finali corrette in ogni pozzetto. - Utilizzando una chemiluminescenza piastra lettore e prima dell'aggiunta di odorizzante, misurare il livello di luminescenza basale della piastra per 2 volte consecutive ad un tasso di 1000 ms per ben 34.
- Rapidamente rimuovere la piastra dal lettore della piastra e aggiungere 25 diluizioni di odorizzante µ l a ciascun pozzetto e immediatamente avviare la misurazione della luminescenza continuo di tutti i pozzetti per 20 cicli entro 30 min.
Nota: Pozzi di pipetta con attenzione per evitare di contaminare i vicini quando si utilizza diversi odoranti e/o concentrazioni differenti dell'odorizzazione stesso nello stesso piatto.
5. Analisi dei dati
- esportare i dati dal software di lettore di piastra chemiluminescenza.
- Calculate normalizzato risposta OR per ciascun punto di tempo utilizzando la formula
(luminescenza N – luminescenza basale) / (luminescenza più alto – luminescenza basale)
dove N = valore di luminescenza di un certo bene; basale = valore medio luminescenza dei due basali valori di luminescenza; più alto = valore più alto di luminescenza di un piatto o un set di piastre.
Nota: A seconda dello scopo dell'esperimento, rappresentazioni grafiche alternativi possono essere adottati. Ad esempio, per lo screening di saggi (Vedi Figura 1) e per la generazione di curve di concentrazione-risposta, il valore di luminescenza di un certo pozzo presso un punto di tempo desiderato durante la misurazione cinetica, ad esempio il valore massimo o il valore finale, può essere utilizzato.
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Representative Results
Muscone è il principale componente aromatico da muschio naturale. Recenti studi OR5AN1 identificato come un recettore umano per muscone e altri composti di muschio macrociclici basati su omologia con il mouse o, MOR215-1, clonato da glomeruli muscone-sensible a reagire a comportarsi topi37,38. Per il repertorio umano OR, il nostro gruppo e il gruppo Touhara di screening anche identificati OR5AN1 come un ricevitore importante per composti di muschio due macrociclici, cyclopentadecanone e muscone, rispettivamente, utilizzando il luciferase assay sistema38,39 .
Usando l'analisi di campo in tempo reale descritto qui, abbiamo proiettato il repertorio umano OR contro 30 µM muscone (Figura 1). Tra il 379 ORs umano proiettato, OR5AN1 emerse con una risposta prominente a muscone, mentre altre RUP e controlli negativi (il controllo di nessun-odore e il controllo di vettore vuoto) non hanno mostrato una risposta significativa. Il controllo positivo testato OR5AN1 contro 30 µM muschio tibetene, un legante per OR5AN1 (dati non pubblicati) e fu utilizzato per normalizzare la risposta delle RUP a muscone. Per la rappresentazione grafica di questo insieme di dati, abbiamo scelto il punto di tempo quando la lettura di luminescenza massimo è stato raggiunto per OR5AN1 contro 30 µM muschio tibetene.
Dopo abbiamo esaminato la relazione concentrazione-risposta dell'odore-coppia OR con 3 differenti concentrazioni di muscone. Per ogni concentrazione di muscone testato, durante i primi 20 min dopo l'aggiunta di muscone, la risposta di OR5AN1 aumentato gradualmente e poi stabilizzato negli ultimi 10 min (Figura 2A), mentre la traccia per il controllo di nessun-odore aggiunta (0 µM muscone) è rimasto relativamente piatto. Concentrazioni più elevate di muscone evocato le risposte rispetto a quelle inferiori, che è distinguibile in tutta la misura più forte-OR. Usando l'ultimo punto di tempo dalla misura cinetica, abbiamo generato una curva di concentrazione-risposta e la concentrazione per il 50% del valore di effetto massimo (CE50) della curva è stimata per essere 20.82 µM (Figura 2B).
Figura 1: Screening per umano ORs di muscone.
379 ORs umano unico sono stati schermati contro 30 µM muscone usando l'analisi di campo in tempo reale. Colorato blocchi lungo il x-asse indicano diverse famiglie OR umane. Ogni colonna sulla x-asse rappresenta un singolo tipo di OR fatta eccezione per le ultime tre colonne, che sono la risposta di OR5AN1 a 30 µM muschio tibetene (controllo positivo), la risposta del OR5AN1 per la soluzione di HBSS/HEPES/glucosio (un controllo negativo no-odore), e la risposta di Rho-pCI a 30 µM muscone (un controllo negativo vettore vuoto), da sinistra a destra. y-asse rappresenta luminescenza normalizzato a 30 min dopo l'aggiunta di odorizzante quando la risposta ha raggiunto un massimo per il controllo positivo (N = 3). Tutte le risposte sono normalizzate per il controllo positivo. Barre di errore rappresentano la media di errore standard (SEM). Per chiarezza, vengono visualizzate solo le barre di errore positivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Misure cinetiche della risposta del OR5AN1 di muscone.
(A) in tempo reale di OR5AN1 attivazione di muscone di concentrazioni differenti e un controllo negativo no-odore sono state effettuate entro 30 min di odorizzante aggiunta. Freccia indica il punto di tempo dell'odorizzante aggiunta. (B) curva di OR5AN1 concentrazione-risposta contro muscone a 30 min dopo l'aggiunta di odorizzante. y-assi rappresentano luminescenza normalizzato (N = 3). Tutte le risposte sono normalizzate per la massima risposta a 100 µM muscone. Barre di errore rappresentano SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Plasmide | Importo per piastra a 96 pozzetti (µ g) |
| Rho- o | 5 |
| RTP1S | 1 |
| M3R | 0,5 |
| variante di biosensore cAMP | 1 |
Tabella 1: Componenti della miscela transfezione.
Per la quantità di piastra a 96 pozzetti della Rho-OR, RTP1S, M3R e i plasmidi variante biosensore cAMP in tempo reale.
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Discussion
Misurare accuratamente l'attivazione di un OR sopra l'esposizione ad una certa odorant è il primo passo nel decifrare la codificazione delle informazioni olfattive. Gli esperimenti dimostrato in questo studio rappresentano che un esempio di come uno può identificare, mediante uno in vitro sistema di espressione OR, ORs reattivo tra il repertorio umano OR per l'industria chimica odorosa di interesse e successivamente che caratterizzano il recettore farmacologia utilizzando varie concentrazioni della sostanza chimica. I nostri risultati confermano OR5AN1 come un recettore di bona fide per muscone. Questo è coerenza con un precedente rapporto39 e fornisce ulteriore prova per la speculazione che solo un piccolo numero di recettori è coinvolti nel rilevamento del muschio odore27,40. Quando confrontati con i dati di proiezione da Sato-Akuhara et al. generato mediante il saggio di luciferasi in un sistema di espressione eterologa o simili, i nostri risultati di screening ha mostrato leggermente peggiore rapporto segnale-rumore. Oltre le variazioni inerenti le diverse tecniche coinvolte, la differenza nell'output potrebbe essere dovuto al fatto che abbiamo usato una concentrazione più bassa di muscone (30 µM vs 100 µM). Infatti, il valore di50 CE della curva concentrazione-risposta del OR5AN1 contro muscone che abbiamo ottenuto via l'analisi di campo in tempo reale è la stessa grandezza di quello che Sato-Akuhara et al. ottenuti nel loro sistema di saggio di luciferasi, dimostrando risultati comparabili per lo stessa OR espressione sistema eterologo anche quando vengono utilizzati metodi di rilevazione diverse. In un altro studio, il nostro gruppo ha trovato che il sistema di campo in tempo reale potrebbe essere leggermente più sensibile rispetto al sistema di gene del reporter di luciferase nel valutare la selettività del ricevitore di OR2T11, dato che un piccolo numero di odorizzazione era attivo solo nel precedente, ma non in quest'ultimo sistema35. Se confrontato con la serie di dati riportati da Geithe et al. 31 il OR1A1 contro (+)-carvone, i nostri dati su OR5AN1 contro muscone hanno mostrato un ritardo nel tempo necessario per raggiungere l'altopiano, che potrebbe derivare direttamente dai generi differenti di ORs e odoranti utilizzato. In altri dati in tempo reale analisi accampamento segnalati dal nostro gruppo, abbiamo anche dimostrato diverse volte a picco a seconda il RUP e odoranti34,35. Inoltre, diverse linee cellulari usati per esprimere ORs, diverso substrato usato, plasmidi variante biosensore cAMP in tempo reale diversi, diversa sensibilità di lettore di piastre di chemiluminescenza, e/o diverse condizioni sperimentali, come variazione in temperatura ambiente, potrebbero tutti contribuiscono alle variazioni nell'output di luminescenza.
Il campo in tempo reale presenta parecchi vantaggi sopra altri metodi per misurare l'attivazione OR. Prima, simili per l'analisi del gene del reporter luciferasi, il dosaggio di campo in tempo reale fornisce un mezzo aggiuntivo in vitro di alto-rendimento identificazione dei repertori OR rispondendo a odoranti. Schermi del recettore e/o odorant su larga scala mediante l'analisi di campo in tempo reale possono offrire una grande quantità di informazioni sul recettore-odore abbinamento con l'uso di un piccolo numero di piastre. Quando avanzate luminometri e pipettaggio robot sono disponibili, il protocollo di 96 pozzetti descritto qui può essere facilmente aggiornato formato 384 pozzetti, in cui ancora meno DNA plasmidico e reagenti sono necessari per unità di output dei dati. In secondo luogo, il metodo di campo in tempo reale è in grado di misurare i cambiamenti nella concentrazione intracellulare di cAMP in tempo reale. Mentre sono più test utilizzato per misurare l'attività OR a data base di fluorescenza o chemiluminescenza endpoint detection che richiedono lisi delle cellule, il campo in tempo reale analisi isimplemented in condizioni non litici, cellule vive che sono più simili all'endogena situazione e che consentono il monitoraggio dei cambiamenti nei livelli di cAMP. In terzo luogo, un tempo relativamente breve è necessario per eseguire il metodo in tempo reale. Un altro metodo di analisi di alto-rendimento della funzione OR, che si basa su un'espressione di gene reporter luciferasi, necessita di ulteriori 4 h dopo la stimolazione di odore per la realizzazione di un esperimento. In alcuni casi, un intervallo di incubazione prolungata odore può provocare tossicità potenziale odorant alle cellule, che è attenuata efficacemente sotto esposizione transitoria. Inoltre, negli esperimenti di più lunga durata, le possibilità di contaminazione dei pozzi vicini di volatilizzazione quando si utilizza diversi odoranti e/o le concentrazioni differenti della stessa odorant nello stesso piatto inoltre sono aumentate. Rilevamento immediato seguito odore aggiunta rende il dosaggio di campo in tempo reale un paradigma rapido e affidabile.
Le limitazioni del campo in tempo reale di analisi per la misurazione o l'attivazione è come segue. In primo luogo, la nostra analisi in vitro si basa su una linea cellulare derivata HEK293T che manca di molte molecole endogene dei neuroni sensoriali olfattivi nativi. Inoltre, proteine solubili e conversioni enzimatiche che si verificano nel muco nasale possono associare con odoranti o influenzare affinità di OR per odoranti. Pertanto, l'attivazione del sistema eterologo può differire dalla situazione in vivo in termini di sensibilità e odore tuning. In secondo luogo, l'identificazione di ORs per un determinato odorant richiede un intero repertorio di OR di almeno una data specie. ORs sono una grande famiglia di GPCR e i numeri delle proteine OR in umani e mouse sono molto grande4,5,41. Molto tempo e sforzo possono essere coinvolti nella clonazione ogni repertorio OR di interesse. In terzo luogo, anche se il sistema di espressione eterologa OR include modifiche sequenza OR (ad esempio il Rho-tag) e alcune proteine chiave o accessorie (ad esempio RTP1S e M3R), abbiamo il sospetto che non tutti i ORs funzionalmente sono espressi sulla membrana cellulare del Cellule HEK293T-derivate. Pertanto, l'assenza di risposte a una certa odorant in vitro non preclude necessariamente OR risposta in vivo, come conseguenza del fatto che alcune RUP potrebbe essere solo scarsamente espresse sulla superficie delle cellule e in grado di riconoscere i loro ligandi. Così, ogni volta che possibile campo in tempo reale dovrebbe essere usato in combinazione con altri saggi in vitro e in vivo per ottenere risultati più convincenti.
Diversi passaggi critici dovrebbero essere data attenzione supplementare durante il dosaggio di campo in tempo reale. In primo luogo, per gli esperimenti che coinvolgono luminescenza in generale, la temperatura è un fattore chiave che influenza il risultato dell'esperimento come aumenti di temperatura fanno diminuire i livelli basali e indotti della luce emessa e diminuzioni di temperatura aumentano potenza luminosa. Di conseguenza, pre-equilibrare le piastre alla temperatura di esercizio allo steady-state del instrumeNT prima odorant aggiunta è necessaria per evitare l'influenza sui risultati dovuti alle variazioni di temperatura. In secondo luogo, le concentrazioni del reagente substrato in tempo reale analisi di campo devono essere regolate secondo la situazione reale. Quando la luminescenza basale non riesce a raggiungere la soglia minima di rilevamento del lettore della piastra di chemiluminescenza, si dovrebbe considerare aumentando le concentrazioni di substrato per aumentare il segnale. Infine, pur essendo una linea aderente cellulare, le cellule Hana3A possono staccare durante l'esperimento. Quando ad aspirazione o aggiungendo il mezzo, mettendo i puntali al lato del pozzo può minimizzare rottura di strato monomolecolare della cellula. È anche importante piatto di cellule in una densità appropriata e uniforme per evitare surclassando le cellule come fitte macchie di cellule tendono a staccarsi durante il cambio del mezzo.
Oltre a identificare OR(s) per un odorant di interesse, il dosaggio di campo in tempo reale può anche essere usato per schermare per ligandi affine per un determinato OR quando sono disponibili librerie di sostanze chimiche. Infine, quando vengono utilizzate tipi di cella appropriata e condizioni di transfezione, il dosaggio può anche consentire il rilevamento di attivazione di GPCR iperespresso o endogeno e dare curve di concentrazione-dipendente risposta per agonisti e antagonisti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro è stato supportato dal Chinese National Science Foundation (31070972), scienza e tecnologia della Commissione della municipalità di Shanghai (16ZR1418300), il programma per Innovative Research Team di Shanghai Municipal Education Commission, orientale di Shanghai Programma di studioso (J50201) e il programma di ricerca di base nazionale della Cina (2012CB910401).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, without calcium or magnesium | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, with EBSS and L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, without calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, with 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
References
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