Optische coherentie tomografie: Beeldvorming muis retinale Ganglion cellen In Vivo
Summary
Dit manuscript wordt een protocol voor de beeldvorming in vivo van het netvlies van de muis met hoge resolutie spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) beschreven. Het richt zich op netvlies peesknoopcellen (regering van Cambodja) in de peripapillary regio, met verschillende scannen en kwantificeren van de aanpak beschreven.
Abstract
Structurele veranderingen in de retina zijn gemeenschappelijke uitingen van oogheelkundige ziekten. Optische coherentie tomografie (OCT) kan hun identificatie in vivo— snel, herhaaldelijk en met een hoge resolutie. Dit protocol beschrijft OCT beeldvorming in het netvlies van de muis als een krachtig hulpmiddel om te studeren optic neuropathieën (OPN). De OCT-systeem is een interferometrie gebaseerde, niet-invasieve alternatief voor gemeenschappelijke postmortaal histopathologisch testen. Het biedt een snelle en nauwkeurige beoordeling van retinale dikte, de mogelijkheid voor het bijhouden van wijzigingen, zoals netvlies uitdunnen of verdikking. Wij presenteren de beeldvorming proces en analyse met het voorbeeld van de Opa1delTTAG muis lijn. Drie soorten scans worden voorgesteld, met kwantificering op twee manieren: standaard en zelfgemaakte remklauwen. De laatste is het beste voor gebruik op het netvlies peripapillary tijdens radiale scans; Being nauwkeuriger, verdient de voorkeur voor het analyseren van dunner structuren. Alle benaderingen die hier worden beschreven zijn ontworpen voor retinale peesknoopcellen (regering van Cambodja) maar zijn gemakkelijk aan te passen aan andere cel populaties. Kortom, OCT is efficiënt in mouse model fenotypering en heeft het potentieel om te worden gebruikt voor de betrouwbare beoordeling van therapeutische interventies.
Introduction
OCT is een diagnostisch hulpprogramma dat de behandeling van retinale structuren1 vergemakkelijkt, met inbegrip van de kop van de oogzenuw (ONH). Door de jaren heen is het geworden tot een betrouwbare indicator van progressie van de ziekte in mensen2,3, evenals in knaagdieren4,5. Het maakt gebruik van interferometrie transversale om afbeeldingen te maken van retinale lagen met een 2-µm axiale resolutie. De binnenste laag is de retinale zenuw vezel laag (RNFL), met axonen van de regering van Cambodja, die wordt gevolgd door de ganglion cellaag (GCL), met meestal regering van Cambodja organen. Volgende halte is de Meervormige binnenlaag (IPL), waar de regering van Cambodja dendrites bipolaire, horizontaal en amacrine cel axonen ontmoeten. Deze, samen met horizontale cellen, vormen de nucleaire binnenlaag (l), en hun uitsteeksels verbinden met fotoreceptor axonen in de Meervormige buitenlaag (OPL). Dit wordt gevolgd door de nucleaire buitenlaag (ONL), met fotoreceptor cel organen, en is gescheiden van de fotoreceptor laag door de beperkende buitenmembraan (OLM), ook wel genoemd het innerlijke segment/buitenste segment (IS / OS) laag. Ten slotte, de laatste waarneembare lagen in het netvlies van de muis zijn de retinale pigment epitheel (RPE) en het vaatvlies (C). De RNFL alleen is normaal te dun om te worden gemeten in muizen; analyseren van de RNFL/GCL is dus, in plaats daarvan beter4,5. Een andere mogelijkheid is de complexe laag van GC, waarin de laatste naast de IPL, waardoor het dikker en dus nog makkelijker te meten LGO scant4. Bijgevolg, OCT kan inzicht geven in de pathologische status van het netvlies, zoals in OPNs.
De dikte van het netvlies van de muis is ook vaak geanalyseerd met post-mortem histologie. Echter, deze techniek gezichten beperkingen met betrekking tot weefsel collectie, fixatie, snijden, kleuring, montage, etc. dus, sommige gebreken, zoals de dikte van de subtiele veranderingen, kunnen niet worden gedetecteerd. Ten slotte, omdat het dezelfde muis kan niet worden getest op verschillende tijd punten, het aantal dieren per studie sterk toeneemt, in tegenstelling tot voor LGO. Al met al, de niet-invasiviteit, hoge resolutie, mogelijkheid voor herhaling, tijd toezicht op tijd, en gebruiksgemak van de OCT-technologie maken het de methode van keuze in netvlies ziekte studies.
Muismodellen worden gebruikt om te identificeren gene gebreken en ophelderen van de moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan de retinopathies6. OPN is een vorm van retinopathie met aanzienlijke schade aan de oogzenuw (ON), die is samengesteld uit ongeveer 1,2 miljoen regering van Cambodja axonen. OPN kan worden gericht op de ON of kan ondergeschikt zijn aan andere aandoeningen, aangeboren of niet7, hetgeen leidt tot verlies van het gezichtsveld en later, blindheid. Karakteristieke eigenschappen van OPN zijn verlies van de regering van Cambodja en op schade, die kan worden waargenomen in menselijke LGO als RNFL en GCL uitdunnen van2,3. Ondertussen, de pathofysiologie van OPN is nog steeds slecht begrepen, en vandaar de noodzaak voor het testen van muis netvlies blijft.
Dit manuscript beschrijft de beeldvorming en de kwantificering van retinale laagdikte, met behulp van het voorbeeld van de Opa1delTTAG muis lijn8,9, een model van de dominante optic atrofie (DOA)10. Om te beoordelen pathofysiologie van de regering van Cambodja, werden radiaal, rechthoekige en ringvormige scans gekwantificeerd. Dit werd gedaan met de standaard remklauwen verstrekt door de software van de OCT, hetzij met een zelfgemaakte macro ontwikkeld voor een open-source beeldverwerking programma. De standaard remklauwen zijn moeilijk te manipuleren en vaak dikker dan de RNFL/GCL, terwijl de zelfgemaakte remklauwen makkelijk te gebruiken, reproduceerbare en nauwkeuriger zijn. De macro wordt een meting uitgevoerd voor een automatisch gedetecteerde laag, in 5 punten en op vaste posities, aan beide zijden van de ONH in de peripapillary-regio. Het doel van het voorgestelde protocol is te beschrijven van OCT scan overname wilt retinale positionering, met een focus op RGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
De OCT-systeem, een niet-invasieve in vivo imaging methode, biedt hoge resolutie Retina Cross-Country-section-achtige scans. Het belangrijkste voordeel is dus het potentieel voor gedetailleerde analyse, met de prachtige kans tot omzetting protocollen routinematig toegepast op mensen Muismodellen.
In het voorbeeld van Opa1delTTAG mutant muizen resultaten SD-OCT sprake van een toename van RNFL en GC complexe laagdikte, waardoor voor de verdere verkenning van DOA path…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door Inserm, Université Montpellier, Retina Frankrijk, Union nationale des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), vereniging syndroom de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France, en het laboratorium of Excellence EpiGenMed programma.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
References
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., Pagon, R. A., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. 7 (2007), (2007).
- Lenaers, G., et al. Dominant optic atrophy. Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
