Tomografia a coerenza ottica: Imaging Mouse ganglionari cellule In Vivo
Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo per l’imaging in vivo della retina di topo con tomografia a coerenza ottica ad alta risoluzione spettrale dominio (SD-OCT). Si concentra sulle cellule retiniche del ganglio (RGC) nella regione peripapillare, con diverse analisi e quantificazione approcci descritti.
Abstract
Cambiamenti strutturali nella retina sono manifestazioni comuni di malattie oftalmiche. Tomografia a coerenza ottica (OCT) consente la loro identificazione in vivo— rapidamente, in modo ripetitivo e ad alta risoluzione. Questo protocollo descrive la formazione immagine OCT nella retina di topo come un potente strumento per studiare i neuropathies ottici (OPN). Il sistema OCT è un’alternativa non invasivi, basati su interferometria a comuni post-mortem analisi istologica. Esso fornisce una valutazione rapida e accurata di spessore retinico, consentendo la possibilità di tenere traccia delle modifiche, come assottigliamento retinico o ispessimento. Vi presentiamo il processo di imaging e l’analisi con l’esempio della riga del mousedelTTAG Opa1. Sono proposti tre tipi di scansioni, con due metodi di quantificazione: pinze standard e fatti in casa. Quest’ultima è la migliore per uso sulla retina peripapillary durante le scansioni radiali; essere più precisi, è preferibile per l’analisi di strutture più sottili. Tutti gli approcci descritti qui sono progettati per le cellule retiniche del ganglio (RGC) ma sono facilmente adattabili ad altre popolazioni cellulari. In conclusione, l’OCT è efficiente in phenotyping modello del mouse e ha il potenziale per essere utilizzato per la valutazione affidabile degli interventi terapeutici.
Introduction
L’OCT è uno strumento diagnostico che facilita l’esame delle strutture retiniche1, tra cui la testa del nervo ottico (ONH). Nel corso degli anni è diventato un indicatore affidabile della progressione di malattia in esseri umani2,3, così come in roditori4,5. Utilizza interferometria per creare immagini a sezione trasversale degli strati retinici ad una risoluzione assiale di 2 µm. Lo strato più interno è il livello fibre nervose retiniche (RNFL), contenente assoni RGC, cui fa seguito lo strato di cellule del ganglio (GCL), contenenti principalmente RGC corpi. Successiva è lo strato plessiforme interno (IPL), dove si incontrano gli assoni delle cellule bipolari, orizzontali ed amacrine dendriti RGC. Questi, insieme alle cellule orizzontali, formano lo strato nucleare interno (INL) e loro sporgenze connettersi con gli assoni dei fotorecettori nello strato plexiform esterno (OPL). Questo è seguito dallo strato nucleare esterno (ONL), con i corpi delle cellule del fotoricettore ed è separato dallo strato dei fotorecettori di membrana limitante esterna (OLM), chiamata anche il segmento segmento interno/esterno (IS / OS) strato. Infine, gli ultimi strati osservabili nella retina di topo sono l’epitelio pigmentato retinico (RPE) e della coroide (C). Il RNFL da solo normalmente è troppo sottile per essere misurati nei topi; così, analizzando il RNFL/GCL è invece preferibile4,5. Un’altra possibilità è lo strato complesso di GC, che contiene la seconda oltre l’IPL, rendendo più spessa e quindi ancora più facile per misurare il ott scansioni4. Di conseguenza, OCT può fornire informazioni sullo stato patologico della retina, come in OPNs.
In alternativa, lo spessore della retina di topo spesso viene analizzato con l’istologia post-mortem . Tuttavia, questa tecnica volti limitazioni relative alla raccolta di tessuto, fissazione, taglio, colorazione, montaggio, ecc quindi, alcuni difetti, quali i cambiamenti di spessore sottile, non possono essere rilevato. Infine, perché il mouse stesso non può essere testato alle diverse volte punti, il numero di animali per studiare notevolmente aumenta, a differenza per ottobre. Tutto sommato, la non invasività, ad alta risoluzione, con possibilità di ripetizione, monitoraggio in tempo in tempo e la facilità di utilizzo della tecnologia OCT rendono il metodo di scelta negli studi di malattia retinica.
Modelli murini vengono utilizzati per identificare i difetti del gene e per delucidare i meccanismi molecolari alla base di retinopatie6. OPN è una forma di retinopatia con notevoli danni al nervo ottico (ON), che si compone di circa 1,2 milioni gli assoni RGC. OPN può essere focalizzata su ON o può essere secondaria ad altre patologie, congeniti o non7, che conduce a perdita del campo visivo e più tardi, cecità. Tratti caratteristici di OPN sono RGC la perdita e il danno, che può essere osservata in OCT umano come RNFL e GCL assottigliamento2,3. Nel frattempo, la patofisiologia di OPN è ancora poco conosciuta, e quindi la necessità di testare le retine del mouse rimane.
Questo manoscritto descrive l’imaging e la quantificazione di spessore di strato retinico, utilizzando l’esempio di Opa1delTTAG mouse linea8,9, un modello di atrofia ottica dominante (DOA)10. Per valutare la patofisiologia RGC, scansioni radiali, rettangolare e anulare sono stati quantificati. Questo è stato fatto con pinze originali fornite dal software OCT o con una macro fatti in casa, sviluppato per un programma di elaborazione di immagini open source. Le pinze di serie sono difficili da manipolare e spesso più spessa di RNFL/GCL, mentre le pinze fatte in casa sono facili da usare, riproducibili e più precisa. La macro esegue una misurazione per un livello rilevato automaticamente, in 5 punti e in posizioni fisse, su entrambi i lati di ONH nella regione peripapillare. L’obiettivo del protocollo presentato è di descrivere acquisizione scansione OCT per specificare il posizionamento della retina, con un focus su RGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema di OCT, un non-invasiva in vivo imaging metodo, fornisce scansioni simil-cross-sezione della retina ad alta risoluzione. Così, il suo principale vantaggio è il suo potenziale per un’analisi dettagliata, con la meravigliosa opportunità di recepire i protocolli ordinariamente applicati agli esseri umani di modelli murini.
Nell’esempio di Opa1delTTAG topi mutanti, SD-OCT risultati hanno mostrato un aumento di spessore di strato complesso RNFL e GC, che h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da Inserm, Université Montpellier, Francia di Retina, Union National des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), associazione sindrome de Wolfram, la Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France e il laboratorio di eccellenza Programma di EpiGenMed.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
References
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