광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰
Summary
이 원고는 고해상도 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월)와 마우스 망막의 비보에 이미징에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 몇 가지 검색 및 측정 방법 설명 peripapillary 지역에서 망막 신경 절 세포 (RGC)에 초점을 맞추고.
Abstract
망막에 구조 변경 안과 질병의 일반적인 발현 됩니다. 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 그들의 식별에서 비보에있습니다-빠르게, 반복적으로, 그리고 높은 해상도. 이 프로토콜 광섬유 neuropathies (OPN)를 공부 하는 강력한 도구로 마우스 망막에 10 월 영상을 설명 합니다. OCT 시스템은 일반적인 사후 조직학 분석을 간섭계 기반, 비-침략 적 대안 이다. 그것은 망막 엷게 또는 두껍게 등의 변경 내용을 추적 하는 가능성을 허용 하는 망막 두께의 신속 하 고 정확한 평가 제공 합니다. 선물이 Opa1delTTAG 마우스 라인의 예제와 이미징 프로세스 및 분석. 세 가지 유형의 스캔, 정량화 방법으로 두 제안: 표준 및 수 제 캘리퍼스. 후자는 peripapillary 망막에서 사용 하기 위해 최고의 동안 방사형 검사; 더 정확 하 게 되 고, 하는 것이 얇은 구조를 분석 하는 데 좋습니다. 여기에 설명 된 모든 접근 하지만 망막 신경 절 세포 (RGC) 설계는 다른 세포 인구에 쉽게 적응할 수 있다. 끝으로, 10 월 마우스 모델 형질에 효율적 이며 치료 개입의 신뢰할 수 있는 평가 위해 사용 될 가능성이 있다.
Introduction
10 월 망막 구조1, 시 신경 머리 (ONH) 등의 검사를 용이 하 게 하는 진단 도구입니다. 년 동안 인간2,3, 설치류4,5에서 뿐만 아니라 질병 진행의 신뢰할 수 있는 표시기 되고있다. 간섭계를 사용 하 여 2 µ m 축 해상도 망막 층의 단면 이미지를 만듭니다. 안쪽 층은 망막 신경 섬유 (RNFL), 포함 된 레이어 RGC 축 삭, 신경 절 세포 레이어 (GCL), 주로 RGC 시체를 포함 하 여 뒤. 다음은 내부 plexiform 계층 (IPL), RGC dendrites 바이 폴라, 수평, 그리고 amacrine 세포 축 삭을 만나는 곳입니다. 가로 셀, 함께이 형성 안 핵 층 (INL), 그리고 그들의 돌출 외부 plexiform 레이어 (OPL) 축 삭 포토 리셉터와 연결. 이 포토 리셉터 세포 기관과 외부 핵 층 (ONL), 뒤 및 외부 제한 막 (옴), 내부 세그먼트/외부 세그먼트 라고도 포토 리셉터 계층에서 분리 (IS / OS) 계층. 마지막으로, 마우스 망막에 마지막 관찰 레이어는 망막 안료 상피 (RPE) 및 맥락 막 (C). 혼자 RNFL은 일반적으로 너무 얇은 쥐;에서 측정 따라서, 낫4,5는 대신 RNFL/GCL을 분석입니다. 또 다른 가능성은 IPL 뿐만 아니라 후자 포함 된 GC 복잡 한 레이어, 두꺼운 고 따라서 더욱 쉽게 10 월 측정 스캔4. 따라서, 10 월에 OPNs와 같은 망막의 병 적인 상태에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
또는, 마우스 망막의 두께 종종 사후 조직학으로 분석 했다. 그러나,이 기술은 얼굴 제한 관련 된 조직 수집, 고정, 절단, 얼룩, 장착, 등 그러므로, 미묘한 두께 변화 등 몇 가지 결함이 감지할 수 없습니다. 마지막으로, 같은 마우스 테스트할 수 없습니다에서 여러 시간 때문에 점, 당 동물의 수 공부 크게 증가와 달리 10 월. 모두 모두, 반복에 대 한 비 침해, 고해상도, 가능성, 시간 시간, 및 10 월 기술 사용의 용이성에 모니터링 할 선택의 방법 망막 질병 연구에.
마우스 모델은 유전자 결함을 식별 하 고 retinopathies6기본 분자 메커니즘을 명료 하 게 하는 데 사용 됩니다. OPN는 약 1.2 백만 RGC axons 이루어져 있다 (에), 망막 시 신경에 상당한 손상의 형태입니다. OPN ON에 집중 될 수 있다 또는 선도 시야 손실 후, 실명 아닌7또는 다른 장애, 선천적인된 보조 수 있습니다. OPN의 특성을 특성 RGC 손실 되며 손상에는 관찰 될 수 있다 인간 10 월에 RNFL와 GCL 숱이2,3. 한편, OPN의 이상, 아직도 제대로 이해 하 고 따라서 마우스 망막 테스트 필요가 남아 있다.
이 원고는 이미징 및 Opa1delTTAG 마우스 선8,9, 지배적인 광섬유 위축 (DOA)10모델의 예를 사용 하 여 망막 층 두께의 정량화를 설명 합니다. RGC 이상 평가, 방사형, 직사각형, 그리고 환상 검사 정량 했다. 이것은 10 월 소프트웨어에서 제공 하는 표준 캘리퍼스 또는 오픈 소스 이미지 처리 프로그램 개발 만든 매크로 이루어졌다. 만든 캘리퍼스는 사용 하기 쉬운, 재현, 그리고 더 정확 하 게 표준 캘리퍼스 조작 하기 어렵고 종종 RNFL/GCL, 보다 두꺼운 있습니다. 매크로 5 포인트에서와 peripapillary 지역에서 ONH의 양쪽에 고정된 위치에서 자동으로 검색 된 계층에 대 한 측정을 수행합니다. 제시 프로토콜의 목표 10 월 스캔 수집 RGCs에 초점을 맞춘 망막 위치 지정을 설명 하는입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT 시스템은 비-침략 적 vivo에서 이미징 방법, 고해상도 망막 교차 section 같은 검사를 제공 합니다. 따라서, 그것의 주요 이점은 정기적으로 마우스 모델에 인 간에 게 적용 하는 프로토콜을 바꾸어 좋은 기회와 상세한 분석을 위한 잠재력 이다.
Opa1delTTAG 돌연변이 생쥐의 예에서는 SD-10 월 DOA 이상9의 추가 탐사에 대 한 허용 되는 RNFL 및 GC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 Inserm, 몽펠리에 대학교, 망막 프랑스, 연합 국가 des Aveugles에 의해 지원 되었다 외 Déficients Visuels (UNADEV), 협회 증후군 데 볼 프 람, Fondation 부 라 검색 Médicale, Fondation 드 프랑스, 그리고 우수의 실험실 EpiGenMed 프로그램입니다.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
References
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