Structuration des protéines bioactives ou Peptides sur Hydrogel utilisant photochimie pour Applications biologiques
Summary
Dans cette méthode, nous utilisons la photopolymérisation et techniques chimie clic pour créer des motifs protéique ou peptidique sur la surface des hydrogels de polyéthylène glycol (PEG), fournissant immobilisée bioactifs signaux pour l’étude des réponses cellulaires in vitro .
Abstract
Il existe de nombreux stimuli biologiques qui peuvent influencer le comportement et les cellules souches la différenciation cellulaire. Cellule générale culture approches reposent sur des facteurs solubles dans le milieu au comportement de cellule de contrôle. Cependant, ajouts solubles ne peuvent imiter certains motifs, tels que matrix-lié aux facteurs de croissance de signalisation, signalisation de cellules et spatiales indices biochimiques, qui sont des influences communes sur les cellules. En outre, les propriétés biophysiques de la matrice, comme la rigidité du substrat, jouent des rôles importants dans le sort de cellule, qui n’est pas facilement manipulé à l’aide de cellules conventionnelles pratiques de culture. Dans cette méthode, les auteurs décrivent un protocole simple pour fournir des protéines bioactives modelés sur hydrogels synthétiques polyéthylène glycol (PEG) à l’aide de la photochimie. Cette plate-forme permet le contrôle indépendant de la rigidité du substrat et des signaux biochimiques spatiales. Ces hydrogels peuvent atteindre un large éventail de valeurs de rigidité physiologiquement pertinents. En outre, les surfaces de ces hydrogels peuvent être photopatterned avec des peptides bioactifs ou protéines par l’intermédiaire de thiol-ene cliquez sur les réactions de chimie. Ces méthodes ont été optimisées afin de conserver la fonction de protéine après l’immobilisation de surface. Il s’agit d’un protocole polyvalent qui peut être appliqué à n’importe quel protéique ou peptidique d’intérêt à créer une variété de modèles. Enfin, les cellules ensemencées sur les surfaces de ces hydrogels bioactifs peuvent être surveillés au fil du temps qu’ils réagissent aux signaux spécifiques dans l’espace.
Introduction
Il y a de nombreux stimuli qui influencent le comportement de la cellule. En général, techniques de culture cellulaire typique dépendent de facteurs solubles pour provoquer des réponses cellulaires ; Cependant, il y a des limites de cette approche. Ces méthodes ne peuvent afficher correctement tous les motifs de signalisation trouves couramment in vivo. Ces mécanismes de signalisation incluent séquestré des facteurs de croissance, signalisation de cellules et les indices biochimiques spécifiques dans l’espace. En outre, rigidité du substrat peut jouer un rôle important dans la différenciation cellulaire comportement et cellules souches et n’est pas facilement manipulée à l’aide de la commune cell culture pratiques1,2. Biomatériau approches offrent une nouvelle plateforme pour commencer à explorer ces mécanismes de signalisation. En particulier, les hydrogels sont d’excellents candidats pour tuning substrat raideur3,4, immobilisation des protéines et peptides de5,6et en créant des profils spécifiques dans l’espace7, 8.
Les hydrogels sont couramment utilisés comme les échafaudages en génie tissulaire en raison de leurs similitudes biochimiques et biophysiques avec la matrice extracellulaire (ECM)9,10. Polymères naturels sont des choix communs pour les échafaudages, car elles sont biocompatibles et sont retrouvent dans nombreux tissus de l’organisme. La limitation de l’utilisation de polymères naturels comme substrats est qu’ils manquent des fractions chimiques facilement manipulables pour bioconjugaison. En revanche, hydrogels synthétiques, ainsi que PEG, sont excellentes plates-formes pour chimies ciblées11,12. En outre, PEG hydrogels ne pas susciter une réaction cellulaire et donc sont utilisés comme des backbones inertes pour créer des échafaudages bioactifs.
Pour créer des hydrogels bioactifs, photopolymérisation et thiol-ene cliquez sur chimie réactions sont employées. Ces photoréactions nécessitent un photo-initiateur et une source de lumière UV. Lorsque photoamorceurs sont introduits à la lumière UV, obligations casser aux radicaux de la forme. Radicaux de thèses sont nécessaires pour initier la réaction mais peuvent compromettre la bioactivité de protéine12,13. Par conséquent, il est essentiel d’optimiser photo-initiateur et temps d’exposition UV à maintenir la bioactivité de la protéine.
Dans cette méthode, hydrogels sont synthétisés par le biais de l’acrylate d’éthyle-acrylate chaîne croissance photopolymérisation. PEG-diacrylate (PEGDA) monomères réagissent entre eux pour former des réseaux de polymères ramifiés responsable de la structure de l’hydrogel. La concentration des monomères PEGDA au sein de la solution de gel précurseur contrôlera la rigidité du substrat. En raison de la petite taille de l’hydrogel de pore, protéines ECM comme la fibronectine peuvent être facilement intégrés au sein de l’hydrogel aux fins de la fixation des cellules. Enfin, ces hydrogels peut être surface à motifs avec des peptides bioactifs ou protéines par l’intermédiaire de thiol-ene cliquez sur les réactions de chimie. Ici, n’ayant pas réagis acrylates libres au sein du système d’hydrogel réagira avec les thiols libres situés sur la protéine ou peptide lorsqu’il est exposé à la lumière UV. Après que les protéines ou les peptides sont immobilisées sur la surface de l’hydrogel, l’hydrogel peut être stocké à 4 ° C pendant plusieurs semaines sans perdre la bioactivité. Ceci offre la commodité, la planification expérimentale flexibles et la possibilité d’une collaboration entre les laboratoires. Dans l’ensemble, cette plate-forme permet de contrôle biochimique biomécanique et spatial, indépendant des uns des autres, pour l’occasion d’influer sur le comportement cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole fournit une méthode pour créer des profils de protéines bioactives pour applications biologiques. Il y a plusieurs modifications qui peuvent être faites pour adapter ce protocole pour différentes expériences. Tout d’abord, les exigences de raccordement cellule variera pour différents types de cellules. Si on observe initialement fixation des cellules pauvres pour les gels, augmentation de la concentration de la protéine de l’ECM dans la solution de précurseur est conseillé. Autres protéines EC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée principalement par des subventions de l’American Heart Association scientifique Development Grant (12SDG12050083 à G.D.), le National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 à G.D.) et la National Science Foundation (CBET-1263455 et CBET-1350240 à G.D.).
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
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