Кучность биоактивные белки или пептидов на гидрогеля с помощью фотохимии биологических приложений
Summary
В этом методе мы используем фотополимеризации и нажмите химических методов для создания белка или пептида узоры на поверхности полиэтиленгликоля (PEG) гидрогели, обеспечивая иммобилизованных биологически активных сигналов для изучения клеточных реакций в пробирке .
Abstract
Существует множество биологических раздражители, которые могут влиять на поведение и клеточной дифференцировки клеток. Общие клетки культуры подходы полагаются на растворимых факторов в рамках среднесрочной поведение ячейки элемента управления. Однако растворимые дополнения нельзя имитировать определенные сигнализации мотивы, как факторы роста матрица привязкой, ячейке сигнализации и пространственной биохимических подсказки, которые являются общее влияние на клетки. Кроме того биофизические свойства матрицы, таких как субстрат жесткость, играют важную роль в судьбе ячейки, которая не является легко манипулировать, используя обычные ячейки, культивирование практики. В этом методе мы опишем простой протокол предоставлять узорной биоактивные белков на синтетических полиэтиленгликоля (PEG) гидрогели, используя фотохимии. Эта платформа позволяет для независимого управления субстрата жесткости и биохимические пространственными аллюзиями. Эти гидрогели может достичь большого диапазона значений физиологически соответствующей жесткости. Кроме того поверхности этих гидрогели может быть photopatterned с биоактивные пептиды, или белков через тиоловых Эне нажмите химии реакций. Эти методы были оптимизированы для сохранения функции белка после поверхности иммобилизации. Это универсальный протокол, который может быть применен к любому белка или пептида, представляющие интерес для создания различных моделей. Наконец клетки посеян на поверхности этих биологически активных гидрогели может контролироваться со временем, как они реагируют на пространственно определенных сигналов.
Introduction
Есть много стимулов, которые влияют на поведение клеток. Как правило типичных клеток культивирования методы полагаются на растворимых факторов для получения клеточных реакций; Однако существуют ограничения на этот подход. Эти методы не могут точно отображать все сигнализации мотивы встречаются в vivo. Такие сигнальных механизмов относятся поглощенных факторы роста, ячейке сигнализации и пространственно специфические биохимические подсказки. Кроме того подложка жесткости могут играть важную роль в поведение и клеточной дифференцировки клеток и не является легко манипулировать, используя общую ячейку культивирования практики1,2. Биоматериал подходы предлагают новую платформу для начала изучения этих сигнальных механизмов. В частности гидрогели являются отличным кандидатами для настройки субстрата жесткость3,4, иммобилизации белков и пептидов5,6и создание пространственно определенных шаблонов7, 8.
Гидрогели обычно используются как строительные леса в тканевой инженерии, благодаря их биофизических и биохимических сходства с внеклеточного матрикса (ECM)9,10. Полимеры природные являются общий выбор для леса, как они биосовместимых и находятся во многих тканях организма. Ограничение использования природных полимеров в качестве субстратов является, что они не легко манипулировать химических постановление для bioconjugation. С другой стороны синтетические гидрогели, как таковой как КОЛЫШЕК, являются отличным платформ для целевых химия11,12. Кроме того гидрогели PEG не вызывают клеточного ответа и поэтому используются в качестве инертного магистралей для создания биоактивные подмостей.
Для создания биоактивные гидрогели, фотополимеризации и тиоловых Эне нажмите химии, которые заняты реакции. Эти photoreactions требуют фотоинициатора и источник ультрафиолетового света. Когда фотоинициаторы вводятся к ультрафиолету, облигации перерыв в форме радикалов. Диссертации радикалов необходимы для инициирования реакции, но может отрицательно повлиять на белками биологическую12,13. Таким образом крайне важно оптимизировать фотоинициатора и УФ облучения раз сохранить биологическую белка.
В этом методе гидрогели синтезируются путем фотополимеризации роста цепи акрилат акрилат. ПЭГ diacrylate (PEGDA) мономеров реагируют друг с другом в форме разветвленных полимеров сети отвечает за структуры гидрогеля. Концентрация PEGDA мономеров в рамках решения гелем прекурсоров будет контролировать жесткость субстрата. Из-за небольшой размер гидрогеля пор, ECM белки, например фибронектин могут быть легко включены в пределах гидрогеля с целью вложения ячейки. Наконец эти гидрогели может быть с биоактивные пептиды узором поверхности или белков через тиоловых Эне нажмите химии реакций. Здесь непрореагировавшего бесплатно акрилатов в системе гидрогеля будет реагировать с бесплатным тиолов, расположенный на белка или пептида при воздействии УФ света. После того, как белки и пептиды лишенных подвижности на поверхности гидрогеля, гидрогеля может храниться при температуре 4 ° C в течение нескольких недель без потери биологическую. Это обеспечивает удобство, гибкого планирования экспериментальных и возможности для сотрудничества между лабораториями. В целом эта платформа позволяет биомеханических и пространственной биохимических управления, независимые друг от друга, за возможность влиять на поведение сотовых.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол предоставляет метод для создания шаблонов биоактивные белка для биологических приложений. Есть несколько изменений, которые могут быть сделаны адаптировать этот протокол для различных экспериментов. Во-первых требования вложение ячейки будет варьироваться для различн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было главным образом при поддержке грантов от Американской ассоциации сердца ученый развития Грант (12SDG12050083 г.д.), национальные институты здравоохранения (R21HL102773, R01HL118245 к г.д.) и Национальный научный фонд (CBET-1263455 и CBET-1350240 г.д.).
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
References
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
- Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
- Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
- Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
- Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
- Truat’s Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/…/MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017)
- Ellman’s Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017)
- Desalting Columns. GE Life Sciences Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017)
